6. Изоферменты и их роль

Варбург установил, что альдолазы дрожжей из различных животных тканей различаются по ряду св-в. Пепсин, трипсин, химотрипсин также различались по растворимости, рН, температурному оптимуму.

В конце пятидесятых годов биохимики Виланд и Пфлейдерер, а также другие исследователи выделяли из тканей животных чистые кристаллические препараты фермента лактатдегидрогеназы и подвергали их электрофорезу. В результате электрофореза фермент разделялся, как правило, на 5 фракций, имеющнх различную электрофоретическую подвижность. Все эти фракции обладали лактатдегидрогеназной активностью. Таким образом было установлено, что фермент лактатдегидрогеназа присутствует в тканях в виде нескольких форм. Эти формы в соответствии с их электрофоретпческой подвижностью получили обозначение ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3. ЛДГ4, ЛДГ5. (ЛДГ - сокращенное обозначекие лактатдегидрогеназы), причем номером 1 обозначают компонент с наибольшей элсктрофоретической подвижностью.

Исследования иэоферментов лактатдегидрогеназы, выделенных из разных органов животных, показали, что они различаются как по электрофоретическим и хроматографическим свойствам, так и по химическому составу, термостабильности, чувствительности к действию ингибитооров, К_m и по другим свойствам. При анализах лактатдегидрогеназы разных видов животных выявлены очень большие межвидовые различия, однако в пределах данного вида распределение изоферментов характеризуется большим постоянством.

Лактатдегидрогеназа была первым ферментом, отдельные компоненты которого были подвергнуты детальзому изучению. Несколько позднее были получены данные о множественных формах и молекулярной неоднородности ряда других фермеатов, а в 1959 г. было предложено называть такие формы изоферментами или изоэнзимами. Комиссия по ферментам Международного биохимического союза официально рекомендовала этот термин для обозначевия мвожествеинь форм ферментов, того же биологического вида.

Итак, изоферменты - это группа ферментов из одного и того же источника, обладающих одним типом субстратной специфичности, катализирующих одну и ту же химическую реакцию, но различающихся по ряду физико-химических свойств.

Наличие множественных форм ферментов, или изоферментов, установлено более чем для 100 ферментов, выделеаных из различных видов животных, растений и микроорганизмов. Изоферменты не всегда состоят из двух или нескольких субъединиц. У ряда ферментов отдельные изофермсаты представляют собой разные по химическому строению белки, обладающие одной и той же каталитической активностью, но состоящие только из одной субъединицы.

Основным критерием для номенклатуры изоферментов в настоящее время принята их электрофоретическая подвижвость. Это объясняется, тем, что по сравнению с другими способами характеристики изферментов электрофорез дает наиболее высокую разрешающую способность.

К настоящему времени в результате изучения растительных изоферментов установлено, что многие ферменты присутствуют в растениях в виде множественных форм. Познакомимся с некоторыми из этих ферментов.

М а л а т д е г и д р о г е н а з а ( 1.1.1.37 ) имеет довольно сложвый изофермецтный состав. В семенах хлопчатника и листьях шпината обнаружено по 4 изофермента малатдегидрогеназы, различающихся по электрофоретической подвижности, причем молекулярная масса каждого из четырех изофермевтов шпината равнялась примерно 60 тыс. Разные растения содержат неодинаковое число изоферментов малатдегидрогеназы. Например, в семенах различных сорта к пшеницы обнаружено 7-10 изоферментов, в корнях кукурузы - 4-5, а в различных органах горе (корень, семядоли, подсемядольное и надсемядольное колено) обнаруживали 9-12 изофермевтов малатдегидрогеназы, причем число изоферментов изменялось в зависимости от фазы развития растений.

Отмечалась, что молекулярные массы изоферментоэ малатдегидрогеназы иногда существенно различались. Например, в листьях хлопчатника содержится 7 изоферментов малатдегидрогеназы, из которых 4 изофермеета являются изоформами, имеющими различный электрический заряд, но одинаковую молекулярную массу, равную примерно 60 тыс. Пятый изофермент имел молекулярную массу около 500 тыс. и был олигомером по крайней мере одной из изо форм малатдегидрогеназы с молекулярной массой 60 тыс. Так как в этих исследованиях молекулярные массы определяли приближенно, то можао полагать, что этот изофермент состоит из 8 субъединиц изофермента с молекулярной массой 60 тыс.

Устойчивость и восприимчивость растений к болезням часто связана с регуляцией синтеза изоферментов. В качестве ответной реакции на внедрение инфекции у растениий усилива интенсивность обмена вв., прежде всего окислительно-восставовительньных. Поэтому активность ОВ ферментов и число их изоферментов при поражении растений увеличиваются.

Повышевие активности и увеличение числа изоферментов пероксидазы и о-дифенолоксидазы наблюдаются при различных заболеваниях кукурузы фасоли, табака, клевера, картофелям льна, овса и других растении. На рисунке 22 схематически показано изменение числа изоферментов пероксидазы и их активности при поражении томатов фитофторой. Если в листьях здоровых растений содержалось четыре изофермента пероксидазы, то в пораженных листьях их число возрастало до девяти, причем активность всех изо ферментов значительно повышалась.

При изучении изменений в изоферментном составе пероксидазы п полифенолоксидазы митохондрий при вирусном патогенезе устойчивого и неустойчивого к вирусу табачной мозаики видов табака установлено, что вирусная инфекция вызывает качественно различные изменения изо ферментного состава разных по устойчивости видов табака. У устойчивого вида активность ряда изоферментов повышается в большей степени, чем у восприимчивого. Таким образом, в зависимости от потенциальной способности растения к биосинтезу зоферментов изменяется восприимчивость растения к инфекционным заболевакиям.

Глутаматдегидрогеназы

Эстеразы

Амилазы

Сахараза

Биологическая роль изоферментов в растениях.

ИФ свидетельствуют о большой лабильности ферментативного аппарата растений, дает возможность осуществлять необходимые процессы обмена вв. в клетке при изменении условий внешней среды, обеспечивает специфику обмена вв. для данного органа или ткани растений. Способствует приспособляемости растений к изменяющимся условиям вн. среды.

Одновременное присутствие в клетках множественных форм одного и того же фермента, наряду с другими механизмами регуляции, способствует согласованности процессов обмена вв. в клетке и быстрой адаптации растений к изменяющимся условиям среды.

В самом деле мы отмечали, что отдельные изоерменты различаются по температурным оптимумам, оптимумам рН, отношению к ингибиторам и другим свойствам. Отсюда следует, что если, например, резко изменяются температурные условия, которые становятся неблагоприятными для проявления каталитической активности некоторых изоферментов, то их активность подавляется. Однако данный фермеатативный процесс в растениях не прекращается полностью, так как начинают проявлять каталитическую активность другие изоферменты того же фермента, для которых данная температура является благоприятной. Если в силу каких-либо причин изменяется рН реакционной среды, то также ослабляется активность некоторых изоферментов, но вместо них начинают проявлять каталитическую активность изоферменты, имеющие иной оптимум рН. Высокие концентр ации солей подавляют активность многих ферментов, что является одной из причин ухудшения роста растений на засоленных почвах. Однако даже при высоких концентрациях солей в клетках ферментативные процессы не прекращаются полностью, так как отдельные изоферменты неодинаково относятся к повышению концентрации солей: активность одних изоферментов снижается, других повышается..

Устойчивость и восприимчивость к болезням часто основана на регуляции синтеза ИФ.

Биосинтез изоферментов определяется генетическими факторами и каждый вид растений характеризуется специфическим для данного вида набором изоферментов, т.е. проявляется видовая специфичность по изоферментному составу.

Разные органы одного растения различаются по ИФ.Изучение свойств изоферментов лактатдегидрогеназы, выделенных из различных тканей животных показало, что все изофермевты имеют приблизительно одинаковую молекулярную массу (около 140 тыс ) вых условиях, например под действием обработки 42М мочевиной каждый из изоферментов диссоциирует на 4 субъедивицы с молекулярной массой около 35 тыс. Таким образом, каждый из пяти изоферментов лактатдегттдрогеназы представляет собой тетрамер. Установлено что все изоферменты лактатдегирогеназы представляют собой возможные комбинации всего лишь субъединиц двух типов, условно обозначаемых буквами А и В. Разные сочетания этих типов субъединиц образуют все пять изофермеатов лактатдегидрогеназы (рис. 18). Это показывает, что изоферменты лактатдегидрогеназы имеют строго упорядоченную структуру, причем отдельные субъединицы в молекуле этого белка-фермента соединевы водородными связями, которые могут быть разорваны под действием концентрированного раствора мочевивы.

Возникает вопрос, чем отличаются друг от друга отдельные субъединицы лактатдегидрогеаазы и с чем связава различная электрофоретическая подвижность отдельных из изоферментов ? На этот вопрос сейчас получены довольно определенные ответы. Оказалось, что субъединицы А и В т- ц аминокислот. Субъединица В содержит большее количество кислых мелочных аминокислот по сравнению с субъединицей А. В связи с этим все изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ1 - ЛДГ2) различаются по количеству этих аминокислот, молекулы их имеют разную величину электрического заряда и разную электрофоретическую подвижность. Изоферменты лактатдегидрогеаазы различаются и по ряду других свойств, в частности константам Михаэлиса Км, отношению к ряду ингибиторов, термостабильности.