7. Локализация ферментов и регуляция их активности

Регуляция ферментативной деятельности.

Одним из важнейшие различии живых и неживых систем является способности первых к саморегуляции. Поскольку в основе жизнедеятельноста лежит ферментативная активность, особое значение приобретает познание принципов ее регуляции.

Существуют два основных пути регуляции ферментативной деятельности в клетке.

• Первый осуществляется за счет новообра­зования белковых молекул. Он требует более длительного времени и больших энергетических затрат («грубая настройка»). Образование новых белков связано с экспрессией соответствующих генов. В результате этого, с одной стороны, может регулироваться количество уже работающих молекул ферментов; с другой - могут появляться белки с новыми ферментативными функциями. В частности, это могут быть ферменты, необходимые для борьбы с проникшей в организм инфекцией, или так называемые белки теплового шока, возникающие в ответ на быстрое повышение температуры. На уровне синтеза регулируется соотношение в клетке изоферментов, вы­полняющих одну и ту же функцию, но с разной эффективностью.

• Второй путь - за счет активации или ин­гибирования деятельности уже имеющихся в клетке ферментов. Он происходит чрезвычайно быстро («тонкая настройка»).

При этом регуляция активности может происходить следующими способами.

1. Конкурентное ингибирование.

Этот тип регуляции состоит в том, что к одному и тому же активному центру ферментативного белка способен присоединиться не только суб­страт реакции, но и структурно подобный ему ингибитор. Эти молекулы конкурируют друг с другом за активный центр: при снижении концентрации субстрата все большее число молекул фермента связывается с ингибитором, и скорость реакции сни­жается. Ускорить реакцию можно, увеличив количество субстра­та, молекулы которого при этом будут вытеснять ингибитор, ­реакция пойдет быстрее. Классическим примером конкурентного ингибитора является малоновая кислота - ингибитор сукци­натдегидрогеназы, окисляющей янтарную кислоту до фумаровой в цикла Кребса.

По этому типу действуют антибиотики - сульфамидные препараты, ингибируя жизненно важные для болезнетворных микроорганизмов ферментативные реакции.

В качестве конкурентного ингибитора может выступать и сам продукт реакции. В этом случае «пере­производство» вещества прекращает его образование. После его частичного расходования реакция вновь активизируется.

2. Аллостерическая(неконкурентная) регу­ляция.

Аллостерический («алло»-разный) фермент имеет в белковой структуре несколько центров, с одним из которых связывается субстрат (АЦ), а к другим могут присоединяться ингибиторы или активаторы реакции (Ал.Ц). Присоединение регулятора приводит к изменению конформации белка, что отражается на активности ФСК (рис.). В качестве регулято­ров, действующих в аллостерических центрах, могут выступать различные органические молекулы - продукты обмена, физиологически активные вещества. В частности, один из фитогормонов - цитокинин - является, по-видимому, активатором РНК-полимеразы, что в конечном итоге приво­дит к усилению синтеза белка. Некоторые ингибиторы, вступая во взаимодействие с аллостерическим центром, необратимо из­меняют конформацию белка и полностью выводят фермент из строя. На этом основано терапевтическое действие пенициллина, который выключает один из ферментов, необходимых бактериям для образования клеточной стенки. Наконец, возможно кова­лентное взаимодействие фермента с какими-либо химическими группами (например, фосфорилирование), что приводит к пре­вращению неактивной или слабоактивной формы в интенсивно действующую.

Рис. Аллостерическая регуляция ферментативной активности (по Я.Мусил и др., 1981)

Направленность и последовательность действия ферментов в осуществлении какой-либо функции достигается их специфичес­кой локализацией в клетке и образованием мулыпиферментных комплексов, осуществляющих одну многостадийную реакцию:

Начальный субстрат А с помощью последовательно действующих ферментов Е₁, Е₂ и Е₃ превращается через промежуточные продукты В и С в конечный - Л, который непосредственно уча­ствует в конкретной функции. Ферменты объединены в комплекс не только функционально, но и структурно: они локализу­ются в цитоплазме близко друг к другу, что обеспечивает сопря­женность и экономичность их действия.

Большую роль в организации мультиферментных комплексов играют органеллы, а также мембраны, способствующие упорядо­чению ферментных белков. В связи с этим даже незначительные изменения в структуре мембран серьезно влияют на функцио­нальное состояние клетки. Особенно чутко реагируют на состоя­ние мембран мнтохондрий и хлоропластов наиболее энергетичес­ки важные процессы, связанные с синтезом АТФ и осущест­вляющиеся сложными, многоступенчатыми мультиферментными комплексами. При резких, быстрых колебаниях внешних условий ферменты могут утратить связь с мембранами. Их свободное

Большинство ферментов действуют внутри той клетки, где они образовались. Их называют эндоферментами. Ферменты, выделяющиеся из клетки и действующие в окружающем их пространстве называются экзоферментами. Экзоферменты корней способствуют превращению веществ в ризосфере и их усвоению.

Все организмы, отдельные органы и ткани многоклеточных организмов отличаются друг от друга характером метаболических процессов, определяемых "набором" ферментов и их активностью. Например, для фотосинтезирующих организмов характерны ферменты биосинтеза углеводов, а для человека и животных - ферменты тромбин и плазмин.

Важную роль в регуляции действия ферментов играет их компартментация - локализация в тех или иных субклеточных структурах - органеллах, компартментах. Внутриклеточная локализация ферментов непосредственно связана с той функцией, которую выполняет данный участок клетки.

В цитоплазме обнаруживаются ферменты гликолиза, спиртового бражения, взаимного превращения сахаров, пептозофосфатного цикла, орнитинового цикла (аргининосукцинат-синтетаза, аргининосукцинат-лиаза), синтеза жирных кислот, синтеза и взаимного превражения аминокислот, многие гидролитические ферменты.

В матриксе митохондрий локализованы ферменты цикла Кребса, -окисления жирных кислот, ферменты орнитинового цикла (орнитин-карбамоилтрансфераза, большая часть карбаматкиназы). Во внутренней мембране митохондрий локализованы Ферменты окислительного фосфорилирования, связанные с образованием АТФ.

В ядрах сосредоточено небольшое число ферментов, в основном это ферменты синтеза нуклеиновых кислот, типичными представителями их являются т- и р-ДНК- полимеразы, РНК-полимераза. Очень богаты по набору ферментов лизосомы, в них широко представлены гидролитические ферменты. Лизосомы участвуют в "переваривании" содержимого фагоцитарных пузырьков, которые при этом сливаются с лизосомами. Такие объединенные образования остаются отделенными мембраной от остальных внутриклеточных что и защищает последние от гидролиза. Вместе с тем при некрозе тканей ферменты лизосом участвуют в расщеплении компонентов самой клетки. У животных лизосомы присутствуют в различных клетках, особенно содержится в лейкоцитах. В пероксисомах сосредоточены ферменты метаболизма гликолевой кислоты и утилизации пероксида водорода. Мембранные структуры богаты цитохромом Р-450, катализирующим ряд биологического гидроксилирования и других В стреме хлоропластов содержится рибулозобисфосфаткарбоксилаза и другие ферменты, участвующие в синтезе углеводов из СО2. В мембраны хлоропластов встроены АТФазы и переносчики электронов, функционирующие в процессе фотосинтеза. Четкая пространственная локализация ферментов в клетке обеспечивает их согласованную деятельность.

Многие биологические катализаторы благодаря их строгому расположению в клетке используют как маркеры тех или иных внутриклеточных структур. Например, кислая фосфатаза локализована в лизосомах, каталаза в , оксидаза *-аминокислот - в пероксисомах, аденилатциклаза - в плазматической мембране, глюкоза-б-фосфатаза, НАДФ.Н- цитохром с - редуктаза - в ЭПР, лактатдегидрогеназа - в цитоплазме, галактозилтрансферазы - в аппарате Гольджи. Однако распределение ряда ферментов внутри клетки может быть неоднотипным у различных представителей живой природы. Так, фосфоенолпируват-карбоксилаза в печени крыс обнаружена в цитоплазме, кролика в митохондриях, а морской свинки - в митохондриях, и в цитоплазме.

Отдельные ткани и органы животных и растений отличаются не только по набору ферментов, но и по их активности. Так, почти у всех тканях млекопитающих содержатся ферменты гликолиза, ЦТК но активности их существенно отличаются в разных по ***** кости клетках. Наибольшая активность ферментов гликолиза, а также креатинкиназы характерна для скелетных мышц, ферме) орнитинового цикла - для печени, РНКазы - для поджелудо железы, глутаминазы - для мозга, глюкуронидазы - для с зенки. Такую особенность тканей используют в клинике при д пестике некоторых заболеваний. В частности, возрастание ак Насти креатинкиназы в сыворотке крови является одним из показателей повреждения мышечной ткани.

Существуют также возрастные изменения в активности и на ферментов в тканях, которые наиболее четко заметны в период эмбрионального развития при дифференцировке тканей.

В клетке многие ферменты действуют обычно одновременно, причем вещество, полученное под действием первого фермента, служит субстратом для следующего фермента и т. д. Образуются так называемые мультиферментаые системы.

Мультифермеатные системы по степени их сложности можно разделить на три группы. К первой группе относятся системы, в которых отдельные ферменты находятся в цитоплазме и не связаны друг с другом. В этих случаях небольшие молекулы субстратов (А, Б, В, Г'), имеющие высокую скорость диффузии, передвигаются от фермента ** к Е, а затем к Е и т. д., причем продукт действия одного фермента является субстратом для другого.

Ко второй группе относятся системы, когда ферменты реагируют в форме ферментных комплексов, лишь с трудом распадающихся на отдельные ферменты. При этом продукт действия одного фермента также является субстратом для другого. Промежуточные соединения обычно не покидают комплекса за счет диффузии (рис. ). Примером такой системы может служить комплекс ферментов, катализирующих синтез жирных кислот (см. рис. ) или окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты) (см. рис. ).

Наиболее высокоорганизованные мультиферментные системы представляют собой комплексы ферментов, связанных с внутриклеточными структурами, например с митохондриями или хлоропластами. Обычно они связаны с мембранами этих структур, и подвергающиеся превращению вещества последовательно передвигаются вдоль цепи ферментов (рис. ). Примером такой системы может служить цепь дыхательных ферментов.

Скорость ферментативных реакций многих мультиферментиых систем может автоматически регулироваться. Обычно скорость реакции поддерживается на определенном уровне в зависимости от концентрации конечного продукта всей цепи реакций. Если концентрация конечного продукта превысит определенный уровень, то этот продукт будет оказывать ингибирующее действие на активность первого фермента, и скрасть превращения субстрата и всей цепи реакций резко снижается. В качестве примера можно привести мультиферментную систему превращения аминокислоты треонина в аминокислоту изолейцин. Этот процесса состоит из пяти реакций, катализируемых взаимосвязанными ферментами (рис. ). Конечный продукт этой цепи реакций - изолейцин в повышенных концентрациях ингибирует активность первого фермента треонинде- замипазы, которая катализирует превращение аминокислоты треонина в а-кето- масляную кислоту. Такое довольно специфическое ингибировакие конечным продуктом называют ивгибировааием по типу обратной связи или ретроингибованием. На другие ферменты этой цепи реакций изолейцин не действует. После того как изолейцин будет выведен из реакционной среды или он подвергнется каким-либо дальнейшим превращениям, в результате чего концентрация понизится, активность фермента треониндезаминазы восстанавливается, и треонин вновь подвергается превращениям.

Обычно у мультиферментных систем такого типа конечный продукт ингибирует фермент называют аллостерическим а конечный продукт, который его ингибирует, - отрицательным эффектором или модулятором. Аллостерические ферменты имеют два различных типа активных центра- каталитический и аллостерический или регуляторный. С аллостерическими центрами связываются эффекторы, или модуляторы в результате чего изменяется структура каталитического центра, и фермент теряет свою активность. После удаления эффектора из аллостерического центра структура каталитического центра восстанавливается, и активность фермента возвращается к прежнему уровню.

Примером ингибирования по типу обратной связи является подавление избытком мальтозы фермента -амилазы.

Кроме отрицательных эффекторов есть и положительные, которые соединяясь с Ал.Ц усиливают активность Ф:

фруктозо-6-фосфат + АТФ Ф-1,6-ДФ + АДФ,

где АДФ - положительный эффектор.

Т.о. можно выделить два механизма регуляции ферментативной активности:

1. Путем изменения условий среды (температура, рН, активаторы, ингибиторы);

2. Действие аллостерических ферментов.