Заняття 7.

Тема: Ріст і розмноження мікроорганізмів. Виділення чистих культур бактерій. Ферменти бактерій. Виділення чистих культур анаеробів.

Актуальність. Одним із вирішальних критеріїв для ідентифікації мікроорганізмів за їхнім фенотипом є біохімічна активність. З цією метою використовують диференціально-діагностичні середовища та сучасні тест-системи. Знання біохімічних процесів та методів виявлення дозволяє правильно підібрати такі середовища і тест-системи.

Патогенні види анаеробних мікроорганізмів викликають важкі хвороби у людей. Для правильної та ефективної діагностики цих захворювань потрібно знати властивості анаеробів, середовища, умови та методи культивування.

Мета і завдання. Засвоїти характеристику культуральних властивостей бактерій на похилому агарі та встановити біохімічні властивості бактерій.

Вміти створити анаеробні умови і вибрати середовища для анаеробів. Засвоїти принципи культивування, виділення чистих культур та ідентифікації анаеробів.

Практичні навики:

1. Вміти провести контроль чистоти накопиченої культури на похилому агарі.

2. Оволодіти технікою пересіву бактеріальних культур на “строкатий ряд” для вивчення біохімічних властивостей бактерій.

3. Оволодіти методами посіву для виділення чистих культур анаеробних бактерій.

4. Вміти виявити та оцінити характер росту анаеробних бактерій на поживних середовищах.

Контрольні питання.

1. Ферменти бактерій, їхня класифікація.

2. Контроль чистоти накопиченої культури на похилому агарі.

3. Середовища для виявлення біохімічних властивостей мікроорганізмів.

4. Біохімічні властивості бактерій, як одні з основних ознак ідентифікації.

5. Середовища для культивування анаеробів.

6. Методи культивування анаеробних бактерій.

7. Методи виділення чистих культур анаеробів.

Тестові завдання.

1. Виберіть правильне твердження: “Конститутивні ферменти, це – ферменти, які:

А. Постійно присутні в клітині

В. Синтезуються клітиною при визначених умовах

С. Беруть участь у транспорті поживних речовин у клітину

D. Беруть участь у диханні

Е. Синтезуються клітиною, отримавши субстрат з довкілля

2. Для встановлення чистоти накопиченої культури на похилому агарі потрібно (більше однієї відповіді)?

А. Посіяти у МПБ і поставити у термостат

В. Вивчити макроскопічно

С. Зробити мазок і при мікроскопічному дослідженні виявити мікроби одного виду

D. Вивчити морфологічні та культуральні властивості

Е. Пересіяти на тверде поживне поживне середовище

3. При розщепленні білків утворюються кінцеві продукти: аміак, індол, сірководень. За допомогою якого індикатору можна виявити присутність сірководню?

А. Ацетату свинцю

В. Щавелевої кислоти

С. Лакмусового папірця

D. Бромтимолового синього

Е. Андреде

4. У анаеробів енергетичні процеси забезпечуються за рахунок:

А. Молекулярного кисню

В. Процесів бродіння

С. Процесів денітрифікації

D. Ферментів дихального ланцюга

Е. Цитохромної системи

5. Виберіть поживні середовище для культивування збудників анаеробних інфекцій?

А. Цукрово-кров'яний агар

В. Гіса

С. Кітта-Тароцці

D. Вісмут-сульфітний агар

Е. Вільсона-Блера

Приклади тестів «Крок 1».

До лабораторії надійшов матеріал із рани хворого. Попередній діагноз - газова гангрена. Яким мікробіологічним методом можна встановити видову приналежність збудника?

A. *Бактеріологічним

B. РІА

C. Бактеріоскопічним

D. Алергічним

E. Серологічним

Ситуаційна задача.

При виділенні чистої культури бактерій на певному етапі було проведено пересів виділеної культури на диференціально-діагностичне середовища. При цьому було отримано такі результати: у пробірках з глюкозою, лактозою, манітом - зміна кольору середовища з жовтого на червоний та наявністю бульбашок газу в поплавках, середовище з сахарозою забарвлення не змінило; у пробірках з МПБ – один індикаторний папірець порожевів. А. Які властивості виділеної культури описано? В. Які ще дослідження проводять на цьому етапі? С. Оцініть інформативність отриманих результатів та зробіть висновок.

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Виділення чистої культури бактерій, 3-й день дослідження. Вивчення культуральних властивостей бактерій на похилому агарі та дослідження чистоти накопичуваної культури.

Принцип дослідження. Полягає у вивченні культуральних властивостей на похилому агарі, а саме однорідного росту виділеної культури (макроскопічне дослідження культури) та перевірка чистоти культури (мікроскопічне дослідження).

Хід роботи: а) вивчити характер росту бактерій: золотистого і білого стафілококів, сарцини, кишкової палички, синьогнійної палички, протею, антракоїду в демонстраційних посівах.

б) вивчити особливості росту виділеної культури на агарі та звернути увагу на однорідність росту. Приготувати мазок, зафарбувати його за Грамом. При мікроскопічному дослідженні переконатись, що культура чиста і в мазку є бактерії одного морфологічного типу. За наявності інших бактерій культура є нечистою і подальшому дослідженню не підлягає.

Практичне значення. Виявлення неоднорідного росту або росту поза штрихом піддає сумніву подальше дослідження культури. При проведенні мікроскопічного дослідження чистої культури, наявність однакової морфології, розмірів та тинкторіальних властивостей вказує, що культура чиста і підлягає подальшому дослідженню.

На цьому етапі вказані дослідження дають орієнтовну оцінку про виділену культуру, але в окремих випадках на їхній основі можна зробити висновок про вид виділених бактерій.

Робота 2. Вивчення методів виявлення біохімічної активності бактерій, 3-й день дослідження. Дослідження біохімічних властивостей виділеної культури.

Принцип дослідження. Базується на вибірковій ферментативній здатності кожного виду бактерій. Для цього виділену культуру культивують на диференціально-діагностичних середовищах або тест-системах, у складі яких є різні вуглеводи і білкові субстрати, що дає змогу встановити цукролітичні та протеолітичні властивості бактерій за продуктами ферментації.

Хід роботи: а) вивчити склад середовища Гіса, виявити зміни у пробірках, викликані бактеріями - розклад вуглеводів до кислоти (зміна кольору індикатора), газоутворення - бульбашки газу у поплавках або в напіврідкому середовищі. Виявити процес розкладу білків з утворенням кінцевих продуктів - сірководню (почорніння індикаторного папірця із ацетатом свинцю), індолу (почервоніння індикаторного папірця із щавлевою кислотою), аміаку (зміна кольору лакмусового папірця). Вивчити тест-системи для біохімічної ідентифікації бактерій ("Стафілотест", "Стрептотест", "Ентеротест", СІП та ін). Звернути увагу на форму випуску та термін придатності. Вивчити правила користування ними.

б) дотримуючись правил асептики, пересіяти петлею культуру з похилого агару в середовище Гіса для визначення здатності бактерій розкладати вуглеводи (глюкозу, лактозу, маніт). Пересіяти чисту культуру у пробірку з МПБ. Після посіву закріпити корком в пробірці індикаторні папірці для визначення продуктів розщеплення білків (сірководню, індолу).

Практичне значення. Встановлення біохімічної активності мікроорганізмів дозволяє визначити вид збудника, як етіологічного чинника захворювання.

Робота 3. Вивчення особливостей культивування анаеробних мікроорганізмів та етапів виділення чистих культур анаеробів.

Принцип дослідження. Полягає у створенні анаеробних умов для культивування різними методами. Це досягається підбором спеціальних поживних середовищ з низьким окисно-відновним потенціалом та шаром вазелінової олії на поверхні; використанням речовин, що поглинають кисень та редукуючих речовин; посівом у високий стовпчик середовища; використанням анаеростатів, мікроанаеростатів, пакетів з газовою сумішшю «Gas Box»; одночасним культивуванням аеробів та анаеробів.

Хід роботи: вивчити зразки середовищ для культивування анаеробних бактерій: Кітта-Тароцці, Вільсона-Блера, молоко, цукровий агар. Вивчення будови мікроанаеростата, дослідити посіви анаеробів у трубках Віньяль-Вейона, на чашках за методом Фортнера, на кров'яному агарі після культивування в мікроанаеростаті, охарактеризувати колонії.

Дослідити демонстраційні посіви, вивчити схеми досліджень за допомогою таблиць. Скласти схему виділення (методи Цейслера та Вейнберга) та ідентифікації чистих культур анаеробів.

Практичне значення. Послідовне виконання всіх етапів виділення чистих культур анаеробів дозволяє продовжити подальше дослідження для встановлення виду збудник .

Складання протоколів. Описати культуральні властивості бактерій в демонстраційних посівах на похилому агарі (робота 1). Описати і замалювати зміни у середовищах при дії бактерій (робота 2). Охарактеризувати культуральні та морфологічні властивості виділеної культури, зробити висновок про її чистоту (робота 3). Описати хід роботи, вказати, на які середовища і з якою метою пересіяна чиста культура (робота 4). Охарактеризувати середовища та методи культивування анаеробів (робота 5). Скласти схеми виділення чистих культур анаеробів (робота 6).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-C.50-51, 54-55, 63-64.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2004.-C.53-54, 661-62.

3.Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. - С.65-71.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Т.: Укрмедкнига, 2004. - С. 64-75.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П.,2002.-C.66-80.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія / За редакцією В.П. Широбокова. – Вінниця., Нова книга, 2011. – с.77-95.