Заняття 5.

Тема: Поживні середовища для культивування мікроорганізмів. Стерилізація. Виділення чистої культури бактерій.

Актуальність. Знання процесів життєдіяльності – дихання, живлення, розмноження мікроорганізмів необхідне для практичної роботи спеціаліста, який займається їх культивуванням. Бактеріологічні лабораторії забезпечуються необхідними середовищами, склад, одержання та призначення яких повинні знати працівники відповідного профілю. Для проведення діагностичних досліджень необхідно знати мету і етапи основного діагностичного методу – бактеріологічного методу (виділення чистої культури).

Різноманітні фізичні і хімічні чинники здатні пригнічувати життєдіяльність небезпечних для здоров’я людини мікроорганізмів. На знаннях характеру впливу на мікроорганізми хімічних і фізичних факторів оточуючого їх середовища ґрунтується вся система заходів боротьби із біологічними патогенами.

Мета і завдання. Вивчення особливостей основних біологічних процесів життєдіяльності мікробної клітини (живлення, дихання, росту, розмноження); вивчення поживних середовищ, умов культивування мікроорганізмів. Оволодіння технікою посіву досліджуваного матеріалу на поживні середовища. Вивчення методів виділення чистих культур бактерій, методів і засобів стерилізації та дезінфекції.

Контрольні питання.

1. Особливості хімічного складу бактерій.

2. Метаболізм бактерій, як спосіб отримання поживного матеріалу та енергії.

3. Механізм живлення бактерій.

4. Класифікація бактерій за типом живлення та характером використання енергії.

5. Принципи культивування бактерій.

6. Поживні середовища, техніка їх виготовлення та класифікація. Вимоги до поживних середовищ.

7. Дія фізичних (температура, тиск, променева енергія) та хімічних факторів на життєдіяльність мікроорганізмів.

8. Визначення понять асептики та антисептики. Дезінфекція і її місце в системі протимікробних заходів.

9. Методи асептики та антисептики.

10. Стерилізація. Методи і засоби стерилізації.

11. Хімічні стерилянти, антисептики і дезінфектанти. Класифікація за хімічною структурою, механізм їх дії.

12. Методи контролю за стерилізацією та дезінфекцією.

Практичні навики.

1. Знати принципи виготовлення звичайних та спеціальних поживних середовищ.

2. Оволодіти технікою посіву матеріалу бактеріологічною петлею на пластинку м’ясо-пептонного агару (МПА) в чашці Петрі.

3. Знати прилади та засоби, що використовуються для знешкодження мікроорганізмів на різних об’єктах.

4. Вміти оцінити результати контрольних тестів, що використовуються для контролю ефективності стерилізації та дезінфекції.

Тестові завдання.

1. Мікроорганізми, що живляться за рахунок органічних сполук господаря, завдаючи йому шкоди, називаються:

А. Автотрофи

В. Гетеротрофи

С. Сапрофіти

D. Паразити

Е. Літотрофи

2. Мікроорганізми, що в процесі своєї життєдіяльності використовують неорганічні речовини з довкілля називаються:

А. Сапрофіти

В. Паразити

С. Ауксотрофи

D. Літотрофи

Е. Гетеротрофи

3. Для виділення чистої культури в перший день дослідження завжди необхідно:

А. Відібрати матеріал у середовище консервування

В. Відібрати матеріал та посіяти на тверде поживне середовище

С. Відібрати матеріал і помістити його у термостат

D. Заразити лабораторну тварину

Е. Провести мікроскопію мазка з матеріалу для встановлення збудника інфекції

4. Мета бактеріологічного методу дослідження –

А. Визначити збудника під мікроскопом

В. Виділити аероба з матеріалу для дослідження

С. Виділити анаероба з матеріалу

D. Виділити чисту культуру бактерій з матеріалу та ідентифікувати її

Е. Вивчити морфологічні та культуральні властивості збудника 5. При виготовленні поживного середовища – МПА – найчастіше застосовується метод, що дозволяє знищити у ньому вегетативні та спорові форми мікроорганізмів, це:

А.Фільтрація через фарфорові фільтри

В. Пастеризація

С. Кип’ятіння

D. Автоклавування

Е. Тиндалізація

Ситуаційна задача.

На середовищі відповідного складу отримано колонії бактерій двох типів, що дозволило віднести їх до різних таксономічних груп. А. Як називаються такі середовища відповідно до класифікації за призначенням? В. Які наступні кроки слід здійснити для встановлення виду виділених мікроорганізмів?

Приклади тестів «Крок 1».

1. Для лабораторної діагностики багатьох інфекційних захворювань використовують бактеріологічний метод. Яка мета 1-го етапу цього методу?

A.*Одержання ізольованих колоній

B. Посів досліджуваного матеріалу

C. Мікроскопія досліджуваного матеріалу

D. Виділення та накопичення чистої культури

E. Ідентифікація досліджуваної культури

2. ДНК-полімераза з Thermus aquaticus - важливий компонент полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Цей мікроорганізм здатний до росту при температурі вище 100 °C і є:

A.*Термофілом

B. Мезофілом

C. Психрофілом

D. Галофілом

E. Хемолітотрофом

3. В бактеріологічній лабораторії необхідно простерилізувати поживні середовища, що містять речовини, які змінюються при температурі вище 100?С (сечовина,вуглеводи). Який спосіб стерилізації повинен вибрати лаборант?

А. *Проточною парою D. Тиндалізацією

В. Парою під тиском в автоклаві Пастеризацією

С. Кип’ятінням

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Поживні середовища та їх виготовлення:

Для культивування мікроорганізмів, насамперед, потрібні поживні середовища. Вони готуються безпосередньо в лабораторіях з натуральних продуктів або з напівфабрикатів, що випускаються мікробіологічною промисловістю. Відповідний склад середовища дозволяє застосувати диференціальний підхід при виділенні та дослідженні мікроорганізмів.

Хід роботи. Вивчити класифікацію поживних середовищ; ознайомитись з методикою виготовлення простих поживних середовищ (МПА, МПБ); вивчити принципи приготування спеціальних середовищ: (кров'яного, сироваткового, глюкозного агарів); елективних (середовища Кеслера, жовчного бульйону); диференціально-діагностичних (Ендо, Левіна, Гіса); синтетичних стандартних поживних середовищ (середовища Сотона). Вивчити вимоги до поживних середовищ.

Практичне значення. Вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах (культивування) є універсальним підходом при їх вивченні. Особливість у вимогах до поживних середовищ та у характері росту на них є важливою характеристикою для визначення виду мікроорганізму.

Робота 2. Методи виділення чистих культур мікроорганізмів.

Принцип дослідження. В природі мікроорганізми співіснують у різних асоціаціях, що не дозволяє вивчити властивості окремих видів. Для цього їх виділяють у чистій культурі.

Хід роботи. Вивчити з допомогою таблиць, схем і демонстраційних посівів методи виділення чистих культур мікроорганізмів: а) методи, що ґрунтуються на механічному

розділенні мікробних клітин: посів за Дригальським, спосіб посіву "штрихами” бактеріологічною петлею; б) методи, що ґрунтуються на використанні біологічних властивостей мікроорганізмів: вибірковій чутливості до антибіотиків, хімічних речовин, дії температури; типу дихання і здатності рости на елективних середовищах; в) використання здатності розмножуватись в організмі чутливих лабораторних тварин та ін.

Практичне значення. Ідентифікація мікроорганізмів за їх фенотиповими характеристиками можлива лише при отриманні одного виду мікроорганізму (чистої культури).

Робота 3. Етапи виділення чистої культури мікроорганізмів.

Принцип дослідження. Дослідження виконується через ряд етапів, виконання послідовності операцій дозволяє виділити чисту культуру аеробів.

Хід роботи. Вивчити з допомогою таблиці-схеми етапи виділення чистої культури мікроорганізмів методом їх механічного розділення. Записати схему «Етапи виділення чистої культури при посіві матеріалу на щільне поживне середовище»:

День	№ ета-пу	Назва етапу	Завдання етапу	Примітка
День1	Етап І	Взяття матеріалу	а) зберегти збудника у матеріалі; б) не забруднити матеріал сторонньою мікрофлорою; в) вберегти себе і оточуючих від зараження
	Етап ІІ	Виготов-лення препарату-мазка, фарбуван-ня його за Грамом та мікро-скопування Посів мате-ріалу на щільне поживне середови-ще	Орієнтовна уява про мікрофлору досліджуваного матеріалу та визначення виду середовища для посіву. Посів на середовища збагачення. Посів на щільні поживні середовища. Одержання ізольованих колоній	При потребі перед посівом роблять первинну обробку матеріалу (переведення у рідку фазу, мікроскопія матеріалу), посів у середовище збагачення
День 2	Етап ІІІ	Макро- і мікро- скопічне досліджен-ня колоній	Характеристики колоній за морфологічними ознаками. Перевірка чистоти колоній
	Етап IV	Пересів ізольованої колонії на похилий агар	Одержання чистої культури
День 3	Етап V	Макро- і мікро- скопічне досліджен-ня культури на похилому агарі	Визначення культуральних властивостей культури, перевірка чистоти культури, дослідження морфологічних і тинкторіальних властивостей культури
	Етап VI	Пересів чистої культури на середови-ща Гіса	Дослідження біохімічних властивостей	На цьому етапі при потребі вивчають антигенні властивості, чутливість до антибіотиків, бактеріофагів, патогенність для тварин, токсигенність
День 4	Етап VII	Облік посівів і реакцій	Ідентифікація культури

Практичне значення. Бактеріологічний метод дослідження називають «золотим стандартом» мікробіологічної діагностики. Виділення збудника в чистій культурі з його ідентифікацією достовірно підтверджує діагноз.

Робота 4. І-й день виділення чистої культури аеробів.

Принцип дослідження. Правильний забір та транспортування забезпечують збереження життєздатності мікроорганізму. Мікроскопія первинного матеріалу дозволяє правильно підібрати поживне середовище.

Хід роботи. Виділити з суміші бактерій чисту культуру бактерій і встановити її вид за морфологічними, тинкторіальними, культуральними і біохімічними властивостями (виконується протягом 4-х занять). Провести мікроскопію мазка, виготовленого з нативного матеріалу і зафарбованого за методом Грама. Засіяти матеріал бактеріологічною петлею штрихами на пластинку МПА в чашці Петрі. Посів проводити при дотриманні умов асептики та безпеки. Підписані посіви помістити в термостат при 37^о С для інкубації.

Практичне значення. Одержання ізольованих колоній на щільному поживному середовищі – є ключовим етапом виділення чистої культури.

Робота 5. Ознайомитися з приладами і засобами для проведення стерилізації в кафедральній мікробіологічній лабораторії.

Стерилізацією в мікробіології називають повне звільнення матеріалу від живих мікроорганізмів, включаючи форми, що знаходяться в стані спокою – спор, цист. Для цього використовують фізичні та хімічні фактори впливу на життєздатність мікроорганізмів.

Хід роботи. Вивчити методи стерилізації та дезінфекції інструментів та матеріалів, які використовуються в практичній діяльності медичних працівників, методи контролю якості стерилізації та дезінфекції.

Скласти таблицю “Методи стерилізації” за схемою:

Назва методу стери-лізації

Основні діючі Факто-ри

Призначен-ня методу

Недоліки методу

Методи контролю Ефектив-ності стерилізації

Практичне значення. Стерилізація та дезінфекція – необхідні повсякденні заходи у діяльності медичних працівників будь-якого профілю. Стерильність поживного середовища та посуду при виділенні чистої культури мікроорганізмів є однією з вимог у роботі мікробіолога.

Складання протоколів: Скласти і записати класифіка-цію поживних середовищ, вивчити на демонстраційних зразках основні середовища та їх інгредієнти (робота 1);записати у вигляді таблиці етапи виділення чистої культури мікроорганізмів (робота 3); записати хід виконання роботи 4; заповнити таблицю “Методи стерилізації”(робота 5).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.46-66.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.50-68, 92-99.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.59-69, 81-92.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 45, 59-71.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П., 2002.-С.77-80.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.88-99.