Хроматографічні методи аналізу. Класифікація методів. Значення досліджень м.С.Цвєта для розвитку хроматографії.

Термін “хроматографія” походить від грецьких слів: “хрома” – колір, “графо” – писати. Хроматографія – найчастіше використовуваний аналітичний метод. Цей метод служить для розділення, ідентифікації та кількісного визначення газоподібних, рідких і твердих речовин з молекулярною масою від 1 до 10⁶ . Це можуть бути ізотопи водню, йони металів, синтетичні полімери, білки та ін. За допомогою хроматографії отримана обширна інформація про будову та властивості органічних речовин багатьох класів. Використання хроматографічних методів для розділення білків серйозно вплинуло на розвиток сучасної біохімії. Хроматографію з успіхом використовують в наукових дослідженнях та в клінічній практиці в найрізноманітніших галузях біології та медицини, у фармації та криміналістиці: для терапевтичного моніторингу у зв’язку з ростом нелегального вживання наркотиків, ідентифікації антибіотиків і віднесенні їх до того чи іншого класу антибактеріальних препаратів, для визначення найважливіших класів пестицидів і для моніторингу навколишнього середовища. Такі переваги як універсальність, експресність і чутливість роблять хроматографію важливим аналітичним методом. Більш, ніж десять праць (1957-1980), виконаних з використанням хроматографічних методів,були нагороджені Нобелівською премією; серед авторів методичних робіт, нагороджених преміями, А.Тизеліус (1948), А.Мартін і Р.Сіндж (1956).

Історія становлення та розвитку хроматографічних методів

Деякі явища, які лягли в основу хроматографічних методів, відомі вже давно. Наприклад, ще в часи Арістотеля морську воду очищували від солей за допомогою деяких видів грунтів. Ще в середньовіччі було відомо, що деякі речовини, наприклад, деревне вугілля, можуть обезбарвлювати розчини. таким способом ще в ХІХ столітті очищували сік цукрового буряка. Однак, це явище по-справжньому було вивчене у кінці ХІХ на початку ХХ століття. Американський вчений хімік і геолог Дей (1895-1925) досліджуючи проби нафти, встановив, що проби нафти, відібрані з різних родовищ і з різних глибин, забарвлені по-різному, тому що нафта фільтрується через шари різних порід. При фільтруванні сирої нафти через колонку, заповнену одним із видів землі. Перші фракції були подібними до легких нафтових перегонів, а за ними вслід фільтрувались важкі висококиплячі фракції.

Російський ботанік М.Цвєт (1872-1919) вивчав пігменти, отримані з хлоропластів. При фільтруванні розчинів пігментів у петролейному ефірі через вузьку скляну колонку, заповнену карбонатом кальцію, він спостерігав розділення початкової суміші на забарвлені зони відповідно до ефективності адсорбції пігментів на даному адсорбенті. ці зони переміщались в колонці з різними швидкостями. Якщо потім замість розчину суміші пігментів у колонку подавали тільки чистий розчинник, то зони переміщались до тих пір, поки не завершувалось їхнє розділення. М.Цвєт назвав цей метод хроматографією, хоча прекрасно усвідомлював, що таким способом можна розділяти і безбарвні сполуки. після розділення він або виймав адсорбент із трубки, розрізав на зони і окремо екстрагував кожну зону, або продовжував вводити розчинник, поступово елююючи окремі зони із трубки, а потім випаровував отримані розчини. М.Цвет вперше опублікував результати своїх досліджень у 1903 р. у Варшаві, а потім доповів про них у 1906 р. на засіданні Німецького ботанічного товариства.

Дивно, що цей високоефективний метод залишався протягом 25 років забутим, хоча хімія природних сполук вкрай потребувала нових, кращих методів розділення. дата відродження цього методу – 1931 р., коли Кун, Ледерер та Вінтерштейн опублікували свої роботи з розділення каротиноїдів.

Починаючи з 1940 року, Тизеліус і Классон розробляли методи аналізу, які базуються на безперервному визначенні оптичних властивостей розчинів, які витікають з хроматографічної колонки. Відповідно до способу виконання та механізму розділення, вони поділяються на три групи:

• фронтальний аналіз;

• витіснювальна хроматографія;

• проявна (елюентна) хроматографія.

Метод розподільної хроматографії був відкритий Мартіном і Сінжем, за що автори отримали у 1952 році Нобелівську проемію. Ними була розділена суміш ацетильованих амінокислот (1941 р.) у колонці, заповненій силікагелем з закріпленою водною фазою. Через яку пропускали хлороформ. Суміш ацетильованих амінокислот. введена в колонку зверху, розділяється відповідно до константи розподілу компонентів на фракції, тобто, в принципі на такі ж “зони”, які отримував М.Цвєт при адсорбційному хроматографуванні рослинних барвників. У 1943 р. Мартін та Сінж замінили силікагель на целюлозу, тому відпала необхідність ацетилювати амінокислоти. В наступному 1944 році Консден, Гордон і Мартін використали як носій для нерухомої фази целюлозу у вигляді фільтрувального паперу і використали декілька розчинників як рухомі фази. Вони також сформулювали принцип двомірної хроматографії.

Про те, що деякі речовини здатні адсорбувати гази, відомо давно. А з 1936 року це явище стало використовуватись в газовій хроматографії. У 1952 р. Джеймс та Мартін запропонували метод газо-рідинної хроматографії, а в 1953 р. Янак вніс істотний вклад в розробку газо-твердофазної хроматографії. За допомогою цього виду хроматографії суміші діляться на довгих колонках, а окремі компоненти аналізуються та визначаються кількісно за допомогою спеціальних детекторів, сигнали яких реєструються автоматично. Прилади такого типу зараз використовуються в багатьох галузях народного господарства для контрою якості різноманітних речовин.

З 1956 року набула поширення тонкошарова хроматографія і в цьому напрямку багато зробив вчений Шталь. У роботах Шталя описується хроматографія на закріплених шарах сорбенту. а також другий варіант цього методу – хроматографія на незакріплених шарах, тобто без вмісту зв’язуючої речовини. Сучасній тонкошаровій хроматографії передували більш ранні варіанти, перший з яких розробили радянські вчені Ізмайлов і Шрайбер у 1938 р. Ці автори провдили розділення на скляних пластинках. на які наносили шари оксиду алюмінію, змішаного з водою, у вигляді пасти. На цих шарах вони проаналізували методом кругової хроматографії екстракти лікарських ростин. Завдяки простоті методу та швидкості проведення експерименту, тонкошарова хроматографія в багатьох галузях витіснила паперову, а також адсорбційну та йонообмінну хроматографію.

В 1959 році Порат і Флодін запропонували новий тип хроматографії – гель-проникаючу хроматографію, інакше, фільтрацію через гель. У процесі розділення відбувається просіювання молекул, а розділення речовин відбувається відповідно до їхньої молекулярної маси. один із варіантів цього методу використовують для визначення приблизних молекулярних мас.

1967 рік ознаменований появою одного з найновіших у наш час хроматографічного методу – афінної хроматографії. В цьому році Порат, Аксен і Ернбек змогли знайти надійний спосіб фіксування афінного ліганду (речовини, яка має хімічну спорідненість до досліджуваної речовини) на відповідному твердому носії.