Самостійна робота 3.

Тема: Цитокіни (монокіни, лімфокіни, інтерлейкіни) та їх значення в імунному процесі.

Актуальність. Знання про цитокіни дає змогу зрозуміти і пояснити цілісність міжклітинних взаємодій у багатоклітинних організмах.

Контрольні питання.

1. Класифікація цитокінів.

2. Особливості цитокінової регуляції.

3. Інтерлейкіни та їх функції.

4. Методи визначення інтерлейкінів в сироватці крові.

5. Інтерферони.

6. Фактори некрозу пухлин.

7. Ростові фактори.

8. Фактор переносу.

9. Хемокіни.

Контроль виконання самостійної роботи.

1. Виберіть речовину – медіатор імунних процесів:

А. С-реактивний білок

В. Фібронектин

С. Інтерферон

D. Інтерлейкін

Е. Перфорин

2. Яку функцію виконують цитокіни?

А. Кілерна

В. Регуляторна

С. Представляюча

D. Транспортна

Е. Рецепторна

3. Назвіть цитокіни з противірусними властивостями:

А. Інтерлейкіни

В. Інтерферони

С. Пропердин

D. Фактор некрозу пухлин

Е. Хемокіни

4. Які цитокіни, секретовані активованим Т-хелпером, призводять до розмноження В-лімфоцитів і утворення клону плазматичних клітин (більше, ніж одна відповідь)?

А. ІЛ-1

В. ІЛ-2

С. ІЛ-4

D. ІЛ-5

Е. γ-ІФН

5. Який інтерлейкін секретує активований фагоцит для стимуляції Т-хелпера?

А. ІЛ-1

В. ІЛ-2

С. ІЛ-3

D. ІЛ-4

Е. ІЛ-5

Приклади тестів «Крок1».

1. При моделюванні запалення нижньої кінцівки у тварини підвищилася температура тіла, збільшився вміст антитіл та лейкоцитів у крові. Які речовини зумовили розвиток цих загальних реакцій організму при запаленні?

А. Мінералокортикоїди

В. *Інтерлейкіни

С. Соматомедини

D. Лейкотрієни

Е. Глюкокортикоїди

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.226 - 234.

2. Воробьев А.А.- Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2008.-С.233 - 234.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.145-147.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 201, 211- 212, 328.

5. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.92-100.

6. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С.26 - 28.

7. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.199 - 202, 205, 225, 269, 297.

8. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.48-49.

9. Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.206-219, 258-283.

Заняття 11.

Тема: Специфічний імунний захист організму. Механізми клітинного та гуморального імунітету. Основи трансплантаційної імунології.

Актуальність. Набутий (специфічний) імунітет – потужна ланка опірності організму інфекційним агентам. Знання імунних механізмів і вміння їх досліджувати необхідне при діагностиці інфекційних захворювань, для оцінки імунного статусу організму, трансплантації органів, вибору препаратів для імунопрофілактики та імунотерапії.

Мета і завдання. Засвоїти знання про властивості антигенів і антитіл, про механізми клітинноопосередкованого та гуморальноопосередкованого імунного захисту організму; про реакцію імунної системи на трансплантант.

Контрольні питання.

1. Антигени. Класифікація, властивості. Антигени мікроорганізмів.

2. Антитіла, їх будова, класифікація, функції.

3. Поняття «специфічний імунний захист організму».

4. Головний комплекс гістосумісності. Класи молекули гістосумісності.

5. Фактори, що беруть участь в клітинній імунній відповіді та їх взаємодія.

6. Фактори, що беруть участь в гуморальній імунній відповіді та їх взаємодія.

7. Форми імунної відповіді (синтез антитіл, імунологічна пам’ять, імунологічна толерантність, ідіотип-антиідіотипова взаємодія).

8. Відповідь імунної системи на антигени трансплантанта.

9. Імунологічні реакції та феномени, якими супроводжується взаємодія антигену і антитіла.

10. Мета застосування серологічних реакцій: серологічна діагностика, серологічна ідентифікація.

11. Реакція аглютинації.

12. Реакція преципітації.

Практичні навики.

Вміти: складати схеми клітинної та гуморальної імунної відповіді, формування імунологічної пам’яті та толерантності, ідіотип-антиідіотипової взаємодії. Оволодіти методами постановки та обліку реакцій, які засновані на утворенні комплексу «антиген-антитіло»

(орієнтовна реакція аглютинації, реакція кільцепреципітації),

Тестові завдання.

1.Виберіть фактори, що беруть участь в клітинній імунній відповіді: 1. Макрофаги. 2. Т-лімфоцити. 3. Комплемент. 4. Інтерферон. 5. В-лімфоцити. 6. Плазматичні клітини. 7. Інтерлейкіни.

А. 1,2,3

В. 1,2,7

С. 1,2,4

D. 5,6,7

Е. 2,5,6

2. Ефекторами гуморальної імунної відповіді є:

А. Т-кілери

В. Інтерферони

С. Плазмоцити

D. Антитіла

Е.В-лімфоцит

3. Гаптени – це:

А. Клітини, що синтезують інтерферон

В. Молекули, що індукують синтез імуноглобулінів

С. Неповноцінні антигени

D. Речовини, що викликають алергічні реакції

Е. Сполуки, що активують фагоцитоз

4. При імунній відповіді організму відбувається продукція антитіл. При взаємодії яких клітин відбувається їх синтез?

А. Макрофагів, Т-помічників, Т-супресорів

В. Антигенпрезентуючих клітин, Т-помічників, В-лімфоцитів

С. Дентритних клітин, Т-помічників, В-лімфоцитів

D. Макрофагів, Т-кілерів, В-лімфоцитів

Е. Макрофаги, Т-ефекторів, В-лімфоцитів

5. Антитіла якого класу довго утримуються на високому рівні при вторинній імунній відповіді?

A. IgA

B. IgM

C. IgG

D. IgE

E. IgD

Ситуаційна задача.

Хворий поступив в інфекційну лікарню зі скаргами на головний біль, нездужання, слабкість. Після проведених досліджень йому було поставлено діагноз “черевний тиф”. А. В якості чого виступає збудник захворювання, потрапивши в організм? В. Які захисні процеси запускаються в організмі хворого? С. Що забезпечує звільнення організму від збудника?

Приклади тестів «Крок 1».

1.У хворої після трансплантації печінки через 1,5 місяці погіршився стан внаслідок початку реакції відторгнення трансплантату. Який фактор імунної системи відіграє вирішальну роль в цій реакції?

A.*Т-кілери

B. Інтерлейкін-1

C. Природні кілери

D. В-лімфоцити

E. Т-хелпери

2. Після опромінювання у людини з’явилася велика кількість

мутантних клітин. Через деякий час більшість із них були

розпізнані і знищені клітинами імунної системи, а саме:

A.*Т-лімфоцитами-кілерами

B. Т-лімфоцитами-супресорами

C. В-лімфоцитами

D. Плазмобластами

E. Стовбуровими клітинами

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Вивчення класифікації антигенів та їх властивостей.

Принцип роботи. Класифікація антигенів грунтується на їх молекулярній масі, біологічному походженні, імуногенності, ступені чужерідності тощо.

Хід роботи: За допомогою демонстраційних таблиць вивчити класифікації антигенів та записати в протокол. Розглянути та вивчити основні властивості антигенів та їх характеристику, у т.ч. антигенів мікробних клітин.

Практичне значення. Форма імунної відповіді, яку досліджують, як при діагностиці так і при розробці лікувальних засобів, залежить від особливості антигенів, тому потрібно знати їх класифікацію та властивості.

Робота 2. Дослідження властивостей антигенів специфічно взаємодіяти з гомологічними антитілами в реакціях «антиген-антитіло». Реакція аглютинації (РА):

Принцип реакції. Феномен орієнтовної реакції аглютинації полягає в здатності антитіл склеювати корпускулярний антиген за наявності електроліту, що супроводжується утворенням агрегатів, які випадають у осад.

Хід роботи: На предметне скло нанести краплю імунної діагностичної сироватки, поряд краплю фізіологічного розчину (контроль). В обидві краплі внести петлею чисту культуру бактерій (антиген). У дослідній краплині під дією антитіл бактерії склеюються, утворюючи пластівці, в тому випадку, якщо антиген джгутиковий, або зерна, якщо антиген соматичний. У контрольній краплі бактерії не склеюються – рідина рівномірно скаламучена.

Практичне значення. РА застосовується для серологічної ідентифікації мікроорганізмів, виділених від хворих (невідомих антигенів), з допомогою відомих антитіл.

Робота 3. Серологічна ідентифікація (виявлення розчинного антигену в реакції преципітації (РП).

Принцип методу. В основі реакції преципітації лежить осадження розчинного антигену під дією специфічних антитіл в присутності фізіологічного розчину.

Хід роботи. У пробірку налити 2 мл преципітуючої сироватки, потім по стінці обережно нашарувати 2 мл досліджуваного розчинного антигену. При позитивній реакції через кілька хвилин з’являється кільце преципітації на межі двох рідин. У контрольних пробірках

(І-а – з преципітуючою сироваткою і фізіологічним розчином, ІІ-а – з нормальною сироваткою і досліджуваним розчиненим антигеном) кільце преципітації не утворюється.

Практичне значення. РП використовують у діагностиці інфекційних захворювань, для вивчення антигенної структури мікроорганізмів, визначення видової належності рідин тіла (крові,сперми) у судовій медицині, а також видової належності білків у складі харчових продуктів при санітарній експертизі.

Робота 4. Вивчення класифікації антитіл, їх будови та властивостей.

Принцип роботи. Класифікація антитіл ґрунтується на відмінностях у будові, молекулярній масі, їх функцій та наявності відповідних рецепторів.

Хід роботи: За допомогою демонстраційних таблиць вивчити структурну будову антитіла, класи імуноглобулінів та їх характеристику.

Практичне значення. Антитіла є основним фактором специфічного гуморального імунітету. Вони активують систему комплементу, взаємодіють з різними клітинами, підсилюють фагоцитоз, тому знати їх будову, механізм дії та час утворення імуноглобулінів різних класів є важливим для оцінки імунного статусу організму та визначення періоду перебігу хвороби..

Робота 5. Вивчення форм імунної відповіді: синтез антитіл, формування імунологічної пам’яті, імунологічної толерантності, ідіотип-антиідіотипова взаємодія.

Принцип роботи. У відповідь на проникнення в макроорганізм чужорідного агента імунна система реагує розвитком низки феноменів – форм імунної відповіді (означені вище), які залежать від властивостей антигена і зводяться до двох: формування антигенреактивних молекул (антитіл-імуно-глобулінів) і антигенреактивних клітин (сенсибілізованих лімфоцитів зі специфічними до антигену рецепторами).

Хід роботи: Розглянути за допомогою демонстраційних таблиць механізми синтезу антитіл, формування імунологічної пам’яті, імунологічної толерантності, ідіотип-антиідіотипової взаємодії. Звернути увагу на взаємодію клітин та медіаторів. Оцінити роль кожного фактору у цих процесах.

Практичне значення. Вивчення типів імунної відповіді лежить в основі діагностичних процесів та лікувально-профілактичних заходів.

Робота 6. Вивчення механізму клітинної імунної відповіді.

Принцип роботи. При низці випадків (повільна гіперчутливість та клітинно- опосередкований цитоліз) реалізація імунної відповіді вимагає присутності імунокомпетентних клітин – клітинно-опосередкований імунітет. У цих випадках імунні реакції залежать від лімфоцитів, які спочатку повинні пізнати антиген, а потім мобілізувати інші клітини для елімінації клітин, що несуть антиген.

Хід роботи: Розглянути за допомогою демонстраційних таблиць механізм клітинної імунної відповіді. Оцінити значення цього процесу в імунному захисті організму.

Практичне значення. Механізм клітинної відповіді визначає терміни та інформативність відповідних показників при діагностиці інфекційних хвороб, їх патогенетичному та етіотропному лікуванні.

Складання протоколів: Записати в протокол: класифікації та властивості антигенів (робота 1); принцип та хід постановки реакцій (роботи 2, 3), будову, класифікацію та функції окремих класів імуноглобулінів (робота 4); схеми форм та механізмів імунної відповіді (роботи 5, 6).

Література.

1.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология,

иммунология. -М., 2005.-С.258-262, 288-291.

2.Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология

и иммунология.-М., 2008.-

С.227-228, 249-251.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П.

Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009.

С.155-159, 161.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.

Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004.

– С. 151-156.

Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.46-77, 103-139, 507-517

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология,

иммунология и вирусология. -С.-П.,2002.-С.183-186, 211-212.

6. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.-

Львів, 2008.-С.136 - 149.

7.Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія(під ред.

акад. Широбокова В.П.) – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.232,

237-239, 261-262, 266-271.

8. Методичний посібник до практичних занять з імунології

9. та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів,

10. 2000. С.50-61.

9.Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.37-39, 221-257, 283-299, 313-328, 580-607.

Заняття 12.

Тема: Серологічні реакції.

Актуальність: Основні напрямки досліджень у практичних імунологічних лабораторіях дозвляють підтвердити клінічний діагноз інфекційної хвороби. Тому знання суті серологічних досліджень, принципів їх постановки, її інформативність – важливе підґрунтя при виборі методу діагностики.

Мета і завдання: Вивчення принципів серологічної ідентифікації мікроорганізмів і серологічної діагностики інфекційних хвороб. Оволодіння методами постановки розгорнутої реакцій аглютинації,преципітації в агарі, непрямої гемаглютинації. Освоєння методики постановки і обліку реакцій лізису і реакції зв'язування комплементу (РЗК).

Контрольні питання.

1. Що дозволяють виявити серологічні реакції?

2. У чому суть серологічних реакцій?

3. Як отримують діагностичні сироватки та діагностикуми?

4. Модифікації реакцій аглютинації( РНГА, латекс-аглютинація)

5. Модифікації реакції преципітації.

Практичні навики.

Оволодіти методами постановки та обліку реакцій, які застосовуються з метою серологічної ідентифікації та діагностики, а саме:

• реакція аглютинації (орієнтовна, розгорнута),

• пасивна реакція аглютинації (РНГА, латекс-аглютинація),

• реакція преципітації (кільцеприцепітації, в агарі,латекс-аглютинація),

• провести облік та оцінити результати реакції бактеріолізу,

• вибрати компоненти для реакції гемолізу, провести облік та визначити титр гемолітичної сироватки,

- визначити мету дослідження, вибрати компоненти та поставити РЗК,

- провести облік та оцінити результати РЗК .

Тестові завдання.

1.Серологічна діагностика інфекційних захворювань передбачає виявлення:

A. Невідомих антитіл

B. Невідомих антигенів

C. Гама-глобулінів

D. Т-лімфоцитів

Е. В-лімфоцитів

2.Серологічну ідентифікацію проводять з метою виявлення :

A. Гама-глобулінів

B. Невідомих антигенів

C. Невідомих антитіл

D. Т-лімфоцитів

E. В-лімфоцитів

3. Серологічна діагностика інфек­ційних захворювань ґрунтується на специфічній взаємодії антитіл з анти­генами. Як називається серологічна реакція, що полягає в склеюванні мікроорганізмів при дії на них спе­цифічних антитіл за наявності елект­роліту?

A. Гемадсорбції

B. Преципітації

C. Зв'язування комплементу

D. Аглютинації

E. Нейтралізації

4. Від хворого виділили чисту культуру мікроорганізму, який продукує токсин. Яку імунологічну реакції слід використати для виявлення токсигенності бактерій?

А. Реакцію преципітації в агарі

В. Реакцію аглютинації

С. Реакцію зв’язування комплементу

D. Реакцію гальмування гемаглютинації

Е.Реакцію непрямої гемаглютинації

5. Гемолітичну сироватку в се­рологічних реакціях використовують:

A. Для встановлення видової на­лежності еритроцитів у судово-ме­дичній експертизі.

B. Для реакції непрямої гемаглю­тинації.

C. Для діагностики гемолітичної хвороби новонароджених при резус-конфлікті.

D. Для реакції гальмування гема­глютинації.

E. Як компонент гемолітичної си­стеми в реакції зв'язування комп­лементу.

6. При постановці реакції зв’язування комплементу в пробірці з досліджуваною сироваткою хворого в системі утворився комплекс “антиген+антитіло+комплемент”. Який компонент слід додати, щоб виявити результат реакції?

А. Гемолітичну систему

В. Гемолітичну сироватку

С. Антиген

D. Еритроцити барана

E. Сироватку крові

7. Видимим результатом позитивної РЗК є:

А. Утворення компактного осаду еритроцитів на дні пробірки

В. Поява кільця преципітації

С. Повний гемоліз еритроцитів

D. Аглютинація еритроцитів.

Е. Випадання в осад комплексу антиген-антитіло

8. В тексті завдання перераховані компоненти серологічних реакцій. 1. Стандартна діагностична сироватка. 2. Фізіологічний розчин. 3. Стандартний антиген-діагностикум. 4. Сироватка хворого. 5. Комплемент. 6. Гемолітична сироватка. 7. Еритроцити барана. 8. Чиста культура бактерій, виділена від хворого. Які з них використовуються для виявлення специфічних антитіл в РЗК?

А. 1, 2, 5, 6, 7. 8

В. 2, 3, 4, 5, 6, 7

С. 1, 2, 5, 6, 7, 8

D 2, 3, 5, 6, 7, 8

E. 1, 2, 3, 5, 7, 8

9. Вкажіть компоненти, необхідні для реакції гемолізу:

А. Еритроцити, фізрозчин, гемолітична система.

В. Еритроцити, комплемент, діагностична сироватка

С. Еритроцити, комплемент, гемолітична сироватка

D. Еритроцити, комплемент, гемолітична сироватка

Е. Еритроцити, комплемент, діагностикум.

Ситуаційна задача.

У лабораторії, що обслуговує пункт по заготівлі шкірсировини, з метою перевірки на інфікованість шкіри збудником сибірки поставлено реакцію термопреципітації. А. У якій фазі (рідкій чи корпускулярній) повинен бути антиген для постановки цієї реакції? В. Який бак- препарат потрібно використати для діагностики? С. За якими ознаками можна судити про позитивний результат реакції?

Приклади тестів «Крок 1».

1. В анотації до препарату вказано, що він містить антигени збудника черевного тифу, адсорбовані на еритроцитах барана. З якою метою використовують цей препарат?

А. Для виявлення антитіл в реакції зв’язування комплементу

В. Для серологічної ідентифікації збудника черевного тифу

С. ^*Для виявлення антитіл в реакції непрямої гемаглютинації

D. Для виявлення антитіл в реакції затримки гемаглютинації

Е. Для виявлення антитіл в реакції Відаля

2. Держсанінспекцією вилучена на базарі партія ковбаси з назвою "свиняча домашня" в зв'язку з підозрою щодо її фальсифікації. За допомогою якої серологічної реакції

імунітету можна ідентифікувати харчовий продукт?

A.*Преципітації

B. РЗК

C. Аглютинації

D. Імунофлюорестенції

E. РНГА

3. До лабораторії доставлена кров хворого на черевний тиф для виявлення антитіл. Яку із перелічених серологічних реакцій слід для цього застосувати?

A.*Реакцію аглютинації

B. Реакцію преципітації

C. Реакцію зв'язування комплементу

D. Реакцію гемаглютинації

E. Реакцію гальмування гемаглютинації

4. В анотації до препарату вказано, що він містить антигени зубдника черевного тифу,

адсорбовані на стабілізованих еритроцитах барана. З якою метою використовують

цей препарат?

A.*Для виявлення антитіл в реакції непрямої гемаглютинації

B. Для виявлення антитіл в реакції зв’язування комплементу.

C. Для виявлення антитіл в реакції Відаля

D. Для виявлення антитіл в реакції затримки гемаглютинації

E. Для серологічної ідентифікації збудника черевного тифу.

5. При обстеженні на бактеріоносійство працівников дитячих закладів у виховательки одного з дитсадків виділена С.diphtheriae. Було проведено дослідження на токсигенність збудника,яке показало, що цей штамм С.diphtheriae не продукує екзотоксин. Яка реакція проводиться при дослідженні на токсигенність дифтерійних бактерій?

A. *Реакція преципітації в агаровому гелі

B. Реакція кільцепреципітації

C. Реакція агглютинації

D. Реакція зв’язування комплемента

E. Реакція імунофлуоресценції

6. З метою серологічної діагностики коклюшу поставлена розгорнута реакція з коклюшним та паракоклюшним діагностикумами. На дні пробірок, до яких було внесено діагностикуми з Bordetella parapertussis, утворився зернистий осад. Які антитіла виявила ця реакція?

А. Бактеріолізини

В. Антитоксини

С. Опсоніни

D. *Аглютиніни

Е. Преципітини

7. Лабораторія одержала набір для серологічних реакцій, до складу якого входять:

а) еритроцитарний діагностикум (стабілізовані еритроцити з адсорбованим на них Vi-антигеном збудника черевного тифу); б) буферний ізотонічний розчин; в) стандартна сироватка з антитілами до Vi-антигена збудника черевного тифу. Для якої серологічної реакції призначений набір?

А.*Пасивної гемаглютинації

В. Зв’язування комплементу

С. Прямої гемаглютинації

D.Гальмування гемаглютинації

Е. Нейтралізації

8. На шкірообробний завод доставили шкіру тварин з району, де реєструється сибірка. Яка реакція застосовується для виявлення термостабільного антигену збудника сибірки в шкіряній та хутровій сировині?

А. *Преципітації

В. Зв’язування комплементу

С. Імунофлюоресценції

D. Аглютинації

Е. Гемаглютинації

Зміст і хід заняття.

Робота 1. Серологічна ідентифікація чистої культури бактерій в реакції аглютинації (РА) (розгорнута реакція аглютинації).

Принцип методу. Різні споріднені види бактерій, а також різні серовари, з яких складаються окремі види бактерій, містять спільні антигенні детермінати. Такі мікроорганізми під час проведення орієнтовної РА можуть перехресно реагувати з однією полівалентною аглютинуючою сироваткою або сумішшю діагностичних сироваток. Тому при позитивному результаті орієнтовної реакції для кінцевої ідентифікації мікроорганізмів ставлять розгорнуту реакцію аглютинації з окремими монорецепторними сироватками.

Практичне значення. Розгорнутою реакцією аглютинації визначать антигенну структуру, титр, що дозволяє ідентифікувати вид збудника за антигенню структурою до сероваріанту.

Робота 2. Постановка реакції преципітації в агарі.

Принцип методу. Суть реакції преципітації в агарі полягає в тому, що специфічні антиген та антитіло дифундують у порах гелю назустріч один одному і, зустрічаючись, взаємодіють між собою, уворюючи комплекс, у вигляді видимої візуально лінії преципітації.

Хід роботи: У шарі спеціально підготованого агару (на буферних розчинах) вирізані 5 лунок. У центральну лунку внесена імунна сироватка, в бокові — досліджувані антигени І, ІІ, ІІІ і ІV. При відповідності одного чи кількох антигенів імунній сироватці в агарі між центральною і відповідною боковою лункою утворюється лінія (дуга) преципітації. Визначити наявність додатньої реакції преципітації в демонстраційних пластинах.

Практичне значення. Метод використовується як для якісного аналізу (підтвердження токсигенності), так і для кількісного визначення антигенів.

Робота 3. Серологічна діагностика. Визначення титру антитіл у сироватці хворого (розгорнута реакція аглютинації).

Принцип методу.Утворення конгломератів, антиген-антитіло, які випадають у осад і видимі неозброєним оком.

Хід роботи: У пробірках приготувати розведення сироватки (в об'ємі 1 мл): 1 : 100, 1 :200, 1 : 400, 1 : 800, К. В останню пробірку для контролю наливають тільки фізіологічний розчин. Розведення сироватки проводять за схемою:

Після додавання антигену пробірки струсити і поставити на 4 год. в термостат, а потім витримати при кімнатній температурі.

ІНГРЕДІЄНТИ	ПРОБІРКИ
	1	2	3	4	5	6
Фізіологічний розчин, мл	1	1	1	1	1	1
Імунна сироватка 1: 50, мл	переносити 1мл з 1-ї в 2-гу, з 2-ї в 3-тю і т. д.; з 5-ї пробірки 1мл вилити
Одержуване розведення сироватки	1: 100	1: 200	1: 400	1: 800	1: 1600	К
Антиген	Діагностикум вносити в кожну пробірку по 1 краплі

Облік реакції. Розглянути, не струшуючи, кожну пробірку і порівняти дослід із контролем. Звернути увагу на наявність помутніння, пластівців, осаду. Визначити характер аглютинації — зернистий осад (0-аглютинація), пластівцевий осад (Н-аглютинація). Визначити інтенсивність аглютинації додатніми знаками і відмітити останню пробірку з додатнім результатом, керуючись наступними ознаками: "4+"—наявність широкого з "нерівним" краєм осаду, рідина над осадом – прозора, при струшуванні пробір­ки—пластівцева чи зерниста завісина в прозорій рідині; "3+" — ви­ражений осад меншого діаметру, над осадом – незначне помутніння рідини, при струшуванні – завісина пластівців чи зерен менших роз­мірів, ніж у попередньому випадку. При подальшому зменшенні діаметру осаду, розмірів пластівців чи зерен, збільшенню мутності рідини при струшуванні ступінь аглютинації відмічається "2+" чи "+" . Наявність на дні пробірки невеликого, компактного осаду з рівним краєм, поява при легкому струшуванні мутних "змійок", які підні­маються із дна пробірки, а при сильному струшуванні — рівномір­ного помутніння рідини без зернистості і пластівців, свідчать про від'ємну реакцію аглютинації "—". Визначити титр антитіл в імун­ній сироватці. Зробити висновок про діагностичне значення реакції аглютинації.

Практичне значення. Розгорнутою реакцією аглютинації визначають титр сироватки, що дозволяє підтвердити протікання інфекційної хвороби.

Робота 4. Серологічна діагностика. Виявлення антитіл та встановлення їх титру в реакції непрямої гемаглютинації ( РНГА).

Принцип методу. Реакція ґрунтується на використанні інертних частинок-носіїв, на яких адсорбовані молекули відомої розчинної специфічної речовини, що бере участь в реакції “антиген-атитіло”. В якості такого інертного носія у даному випадку використовують еритроцити.Завдяки використанню реагентів, адсорбованих на частинках носія,РНГА за своєю чутливістю значно перевищує реакцію прямої аглютинації, преципітації та РЗК.Інтенсивність реакції оцінюють візуально.

Хід роботи: Сироватку хворого розвели у лунках полістиролових планшетів 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, (в об'ємі 0,5 мл). У кожну лунку внесли еритроцитарний діагностикум. Контролі: К₁ -завісина еритроцитів, не оброблених антигеном, + сироватка ; К₂ - сироватка, що не містить антитіл та еритроцитарний діагностикум. Реакція проходить при кімнатній температурі, облік проводиться через 30—45 хв. При позитивній реакції еритроцити аглютинуються внаслідок реакції між антитілами, які є в сироватці хворого, і антигеном, адсорбованим на еритроцитах. При цьому утворюється осад з нерівними краями по всьому периметру дна лунки - "парасолька". В контролях (негативна реакція) — еритроцити неаглютиновані, осідають у центрі лунки щільним скупченням з рівними краями. Визначити найбільше розведення сироватки, в якому пройшла реакція непрямої гемаглютинації. . За титр антитіл вважається найбільше розведення сироватки крові в якому пройшла реакція з утворенням комплексу антиген-антитіло у вигляді осаду на дні пробірки.

Практичне значення. Розгорнутою непрямою реакцією гемаглютинації визначать титр антитіл, що дозволяє підтвердити перебіг хвороби.

Робота 5. Реакція бактеріолізу.

Принцип реакції. Реакція бактеріолізу ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами бактерій і активують комплемент класичним шляхом.Внаслідок цього бактерії руйнуються і МПБ стає прозорим.

Хід роботи: Постановку реакції бак­теріолізу проводять у двох пробірках з МПБ.

В обидві пробірки була засіяна жива культура мікроорганізмів. У дослідну пробірку внесена специфічна імунна сироватка і комплемент. Пробірки по­міщають у термостат на добу. Провести облік реакції, спостерігаючи відсутність росту в дослідній пробірці і наявність росту (помутнін­ня) в контрольній пробірці. Пояснити результати реакції, які спостерігаються.

Практичне значення. Реакція бактеріолізу in vitro є моделлю відповідних реакцій в організмі ,що визначає відповідні патогенетичні механізми.

Робота 6. Реакція імунного гемолізу.

Принцип реакції. Реакції імунного гемолізу належать до реакції лізису,що ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами еритроцитів і активують комплемент класичним шляхом. Внаслідок цього еритроцити руйнуються і суміш реагентів стає прозорою (“лакова кров”).

Хід роботи: Постановка реак­ції гемолізу проводиться за схемою:

Інгредієнти	Пробірки
	1	2	3	4	5
Еритроцити барана (3 % завісина) завісина)	0,5	–	0,5	0,5	0,5
Еритроцити собаки (3 % завісина)	–	0,5	–	–	–
Гемолітична сироватка (містить антитіла до еритроцитів барана)	0,5	0,5	–	0,5	–
Комплемент 1 :10	0,5	0,5	0,5	–	–
Фізіологічний розчин	–	–	0,5	0,5	1,0
	Термостат 37°С—30 хвилин
Очікуваний результат	Ге-мо-ліз	Від-сут­ність ге-мо-лізу	Від-сут­ність ге-мо-лізу	Від-сут­ність гемолізу	Від-сут­ність гемолізу

Облік реакції проводять після витримування пробірок у термо­статі протягом 30 хв. при 37°С. Позитивний результат (гемоліз, лакова кров) відмічають у першій пробірці, де є всі необхідні ін­гредієнти реакції (антиген, специфічні антитіла, комплемент). Ін­ші пробірки — контроль.

Пояснити, чому в контрольних пробірках не спостерігається гемоліз.

Практичне значення. Таку трикомпонентну реакцію гемолізу використовують для визначення титрів гемолітичних сироваток і якості препаратів комплементу.Крім того, вона є частиною таких серологічних діагностичних тестів,як реакція зв’язування комплементу.

Робота 7. Приготування інгредієнтів для реакції зв'язування комплементу:

Хід роботи: а) антиген — завісина вбитих мікробів. Перед поста­новкою РЗК визначають його титр і робочу дозу; б) антитіла — містяться в одній із досліджуваних сироваток. Перед введенням у реакцію всі сироватки інактивують (56°С — 30 хв.) для руйнування комплементу і створення оптимуму колоїдного стану; в) гемолітич­на система — сироватка крові кролика, попередньо імунізованого еритроцитами барана. Перед постановкою реакції встановлюють титр сироватки. Для реакції сироватку розводять до 1/3 титру і да­ють еквівалентну кількість 3% завісини еритроцитів барана; г) комп­лемент — складна білкова система, яка міститься в свіжій сироват­ці крові. Для реакції комплементом служить сироватка крові мор­ської свинки. Титр і робочу дозу комплементу встановлюють у реакції гемолізу.

Робота 8. Постановка і облік реакції зв'язування комплементу (серологічна діагностика).

Принцип методу. РЗК ґрунтується на використанні двох систем “антиген-антитіло”, що конкурують між собою зв’язати комплемент. Перша з них є системою основного досліду, що містить антиген-антитіло. Один із цих реагентів є відомим, а інший - компонентом, що досліджується. До цієї ж системи додають комплемент. Друга,або гемолітична,система складається з еритроцитів барана і гемолітичної сироватки. РЗК відбувається у дві фази. У першій фазі антиген основного досліду взаємодіє з відповідним антитілом,якщо ці обидва реагенти знаходяться у пробірці. Для оцінки результату реакції до дослідної пробірки вносять гемолітичну систему. У другій фазі комплемент зв’язується комплексом ”антиген-антитіло” першої або другої системи, якщо у першій системі не вистачає одного компонента.

Хід роботи: РЗК ставлять за схемою:

Інгредієнти	Пробірки
	1	2	3
Досліджувана сироватка (у розведенні)	0,5	–	–
Сироватка завідомо здорової людини людини	–	0,5	–
Сироватка завідомо хворої людини	–	–	0,5
Антиген (у робочій дозі)	0,5	0,5	0,5
Комплемент (у робочій дозі)	0,5	0,5	0,5
Термостат 37°С— 1 годину, чи 4—8°С—18—20 годин
Гемолітична система	1,0	1,0	1,0
Термостат 37°С - 30 хвилин
Очікувані результати	Затримка гемолізу	Гемоліз	Затримка гемолізу

Провести облік реакції: "4+" – "повна затримка гемолізу" (компакт­ний осад еритроцитів, безколірна рідина над осадом); "3+" – "майже повна затримка гемолізу" (осад еритроцитів, рідина над осадом – злегка зафарбована); "2+" – "часткова затримка гемолізу" (невеликий осад еритроцитів, інтенсивно зафарбована рідина над осадом); "+" – "слабка затримка гемолізу" (осад відсутній, зафарбована непрозора рідина – “лакова кров”); "–" - "гемоліз" (зафарбована прозора рідина).

Практичне значення. РЗК більш специфічна, її застосовують у діагностиці сифілісу (реакція Вассермана), висипного тифу, туляремії, лістеріозу та інших бактеріальних інфекцій, а також багатьох вірусних та протозойних захворювань.

Складання протоколів. Описати принцип реакції (робота 1), принципи, методики постановки реакцій (роботи 2, 3, 4, 5, 6, 8).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С. 328-337.

2. Воробьев А.А.-Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2004.-С. 283-286.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.181-183.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 227-236.

5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С.125-141 .

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.276-279.285-288.

7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25.