Заняття 8.

Тема: Виділення чистих культур бактерій. Фактори патогенності мікроорганізмів. Біологічний метод в мікробіології.

Актуальність. Ідентифікація виділеної чистої культури мікроорганізмів – заключний етап бактеріологічного дослідження. Критерії ідентифікації, способи і методи виявлення є базисними знаннями при вивченні кожного виду мікроорганізмів.

Експериментальне відтворення інфекційного процесу дозволяє вивчити та зрозуміти фізіологію патогенних мікроорганізмів, патогенез та епідеміологію інфекційних хвороб, а також ефективність протимікробних та імунологічних препаратів іn vivo. Експериментальний (біологічний) метод дослідження застосовують при діагностиці захворювань, спричинених мікроорганізмами, що не культивуються іn vitro.

Мета і завдання. Ознайомитись з принципами ідентифікації бактеріальних культур за вимогами «Визначника бактерій». Засвоїти основні критерії ідентифікації чистих культур бактерій. Оцінити біохімічні властивості культур у посівах на диференційно-діагностичних середовищах і у тестових системах.

Вивчити експериментальний метод дослідження і його призначення. Вивчити фактори вірулентності, методи виявлення; поняття “інфекція”, “інфекційний процес” та форми інфекції.

Практичні навики.

1. Засвоїти критерії ідентифікації чистих культур аеробів.

2. Визначити вид виділеної культури бактерій на основі проведених досліджень.

3. Ознайомитись з правилами розтину трупа тварини та первинної обробки матеріалу при експериментальному дослідженні.

4. Оволодіти методом мікроскопічного дослідження мазків – відбитків.

5. Оволодіти методом посіву матеріалу з органів трупа тварини.

6. Провести облік та зробити висновок про патогенність досліджуваних штамів стафілококів.

7. Засвоїти методи вивчення факторів вірулентності, облік результатів та оцінку вірулентності культури.

Контрольні питання.

1. Основні ознаки, за якими визначають вид бактерій.

2. Поняття про біовар, серовар, фаговар.

3. Критерії ідентифікації чистої культур аеробів.

4. Визначення поняття вірулентності та патогенності. Одиниці вірулентності.

5. Мікробні токсини, генетичний контроль, класифікація та властивості, методи одержання для медичних потреб.

6. Інвазивність та агресивність мікроорганізмів.

7. Фактори патогенності мікробів ферментної природи.

8. Дати визначення поняття “інфекція”. Ознаки інфекційного захворювання.

Форми інфекції.

9. Шляхи поширення мікробів та їх токсинів у організмі.

10. Експериментальний метод у мікробіології та його значення.

11. Способи зараження та мікробіологічне дослідження заражених тварин.

Тестові завдання.

1. Який продукт реакції вказує на здатність бактерій розщеплювати вуглеводи?

А. Кислота

В. Аміак

С. Індол

D. Сірководень

Е. Пептон

2. Який висновок про біохімічні властивості чистої культури треба зробити, якщо у пробірці з МПБ один з індикаторних папірців змінив колір на рожевий?

А. Чиста культура розщеплює білки з утворенням сірководню

В. Чиста культура розщеплює вуглеводи з утворенням кислоти і газу

С. Чиста культура не ферментує білки

D. Чиста культура не ферментує вуглеводи

Е. Чиста культура ферментує білки з утворенням індолу

3. За хімічною природою ендотоксини є:

А. Вуглеводами

В. Ліпополісахаридами

С. Білками

D. Ліпідами

Е.Неорганічними речовинами

4. Випадок повторного зараження тим самим видом збудника після повного одужання називається:

А. Реінфекція

В. Рецидив

С. Суперінфекція

D. Хронічна інфекція

Е. Латентна інфекція

5. Яка структура бактеріальної клітини захищає збудник від фагоцитозу та дії антитіл макроорганізму і є важливим фактором патогенності?

А. Клітинна стінка

В. Спора

С. Капсула

D. Екзотоксин

Е. Мікробні ферменти

Приклади тестів «Крок 1».

1. Пацієнт одужав після перенесеної дизентерії Зонне і повторно заразився цим же збудником. Як називається така форма інфекції?

A. *Реінфекція

B. Суперінфекція

C. Персистуюча інфекція

D. Хронічна інфекція

E. Рецидив

2. У дитини з підозрою на дифтерію з зіву виділена чиста культура мікроорганізмів та вивчені їх морфологічні, тинкторіальні, культуральні та біохімічні властивості, які виявилися типовими для збудників дифтерії. Яке дослідження необхідно ще провести для видачі висновку про те, що виділена патогенна дифтерійна паличка?

A. *Визначення токсигенних властивостей

B. Визначення протеолітичних властивостей

C. Визначення властивості розщеплювати крохмаль

D. Визначення цистиназної активності

Е. Визначення уреазної активності

3. У хворого лікар діагностував гостру гонорею. З анамнезу стало відомо, що раніше він переніс гонорею і вилікування було повним. До якої категорії інфекцій можна віднести це нове захворювання?

A. *Реінфекція

B. Суперінфекція

C. Вторинна інфекція

D. Аутоінфекція

E. Рецидив

4. Людина, яка проживала в ендемічному вогнищі, перехворіла 3-денною малярією. Через півтора року після переїзду в іншу місцевість захворіла малярією знову. Яка найбільш вірогідна форма цього захворювання?

A. *Рецидив

B. Реінфекція

C. Суперінфекція

D. Персистуюча інфекція

E. Вторинна інфекція

5. Поворотний тиф, що викликається B. сaucasica, зустрічається лише на певних територіях, де є переносник кліщ роду Alectorobius. Як можна назвати таку інфекцію?

A. *Эндемічною

B. Экзотичною

C. Спорадичною

D. Пандемічною

E. Эпідемічною

6. У дитини, що одужує після кору, розвинулася пневмонія, викликана умовно-патогенними бактеріями. Яка найбільш ймовірна форма цієї інфекції?

А. Персистуюча інфекція

В. Реінфекція

С. *Вторинна інфекція

D. Суперінфекція

Е. Госпітальна інфекція

Ситуаційна задача.

У баклабораторії з гною фурункула було виділено на кров’яному та жовтково-сольовому агарі золотистий стафілокок. А. Які методи мікробіологічної діагностики дозволили встановити вид збудника? В. На основі яких властивостей зроблено висновок. С. Які фактори патогенності було виявлено в процесі виділення збудника?

Зміст і хід заняття:

Завдання 1. Проведення обліку біохімічних властивостей виділеної чистої культури бактерій.

Принцип дослідження. Полягає в реєстрації характерних змін на диференційно-діагностичних середовищі Гіса, МПБ, куди були посіяні культури мікроорганізмів.

Хід роботи: Виявити здатність виділеної культури розкладати вуглеводи до кислоти (зміна кольору індикатора - умовне позначення "К"), або до кислоти і газу (умовне позначення "КГ"). Відсутність змін - умовне позначення " - ". Виявити утворення кінцевих продуктів розпаду білків - сірководню, аміаку, індолу за зміною кольору відповідних індикаторних папірців.

У бульйонній культурі відзначити характер росту: суцільне помутніння, осад і його особливості, наявність кільця, плівки, пігменту.

Практичне значення. Чітке виконання усіх попередніх етапів виділення чистої культури дозволяє отримати достовірні результати біохімічних властивостей виділеної культури.

Завдання 2. Проведення ідентифікації виділеної чистої культури бактерій.

Принцип дослідження. Полягає в ідентифікації виділеної культури за морфотинкторіальними, культуральними та біохімічними властивостями.

Хід роботи: Властивості культури, виявлені на заняттях №5 - №8 записати в таблицю. Порівняти властивості культури з даними "Визначника бактерій", встановити родову і видову назву бактерій та записати її латинськими літерами.

Вид бакте-рій	Морфоло-гічні власти-вості	Культуральні властивості		Біохімічні властивості
		МПБ	МПА	Глюкоза	Лактоза	Маніт	Сірково-день	Індол

Практичне значення дослідження. Встановлення комплексу властивостей виділеної культури дозволяє визначити вид збудника, як етіологічного чинника захворювання.

Завдання 3. Експериментальний метод діагностики інфекційних хвороб. Розтин трупа тварини, що загинула після зараження культурою бактерій.

Принцип методу. Полягає у дослідженні змін в організмі експериментальної тварини спричинених інфекцією

Хід роботи: Дослідження зовнішніх покривів. Оглянути труп, відмітити зміни зовнішніх покривів (наявність виразок, випадіння шерсті, зміни кольору шкіри і т. ін.). Зафіксувати труп тварини на спеціальному столику, поклавши її на спину і розтягнувши кінцівки в сторони. Обробити шкіру спиртом і розрізати по середній лінії живота від нижньої щелепи до лона, а потім зробити розрізи до лапок. Відпрепарувати шкіру. Визначити зміни в підшкірній клітковині (розширення судин, крововиливи, набряки стан лімфатичних вузлів). При наявності змін з боку останніх, зробити посіви на поживні середовища і приготувати препарати – відбитки (предметним склом торкнутися надрізаної ділянки лімфовузла). Розтин і дослідження грудної порожнини. Захопивши пінцетом мечеподібний відросток, зробити під ним надріз і ножицями перерізати з обох сторін ребра у місцях їх з’єднання з грудиною. Відкинути клапоть грудини доверху. Оглянути грудну порожнину, відмітити наявність чи відсутність рідини в ній. Оглянути серце, легені. Посіяти кров із серця. Для цього припекти верхівку серця розжареним скальпелем і, притримуючи серце пінцетом, через пропечену ділянку проколоти серце. Пастерівською піпеткою взяти кров, посіяти в пробірку з МПБ і на сектор МПА. З решти крові, що залишилася в піпетці, зробити мазок. Результати огляду органів грудної порожнини і всі спостереження занести у протокол. Зробити посіви і мазки – відбитки з тканин легень, серця, плевральної рідини. Матеріал для посівів із органів беруть таким чином: припікають поверхню органу і на цьому місці роблять розріз, притримують відрізаний шматочок пінцетом і торкаються поверхнею розрізу до поживного середовища (МПА). Для посіву на бульйон зшкрябують матеріал стерильною петлею. Роблять мазки - відбитки з органів декілька разів торкаючись поверхнею розрізу до предметного скла. Мазки фіксують, фарбують за методом Грама. Розтин і дослідження черевної порожнини. Піднявши пінцетом черевну стінку. Розрізати її від діафрагми до лобка (при цьому не пошкодити кишки). Утворені м’язові клапті відвести убік. Посіяти ексудат у МПА та МПБ. Оглянути і відмітити в протоколі стан органів черевної порожнини (колір, зміни розмірів, консистенцію, вогнища ураження). Вирізати шматочки органів, зробити посіви (на МПБ, МПА) і мазки – відбитки. Мазки – відбитки зафарбувати за методом Грама, мікроскопувати і замалювати. Посіви підписати і поставити в термостат до наступного заняття. При наявності росту у МПБ та на МПА вивчити під мікроскопом мазки з колоній і бульйоної культури. Замалювати і зробити висновок.

Практичне значення. Застосування експериментального методу дає змогу виділити мікроорганізм із досліджуваного матеріалу, коли збудник не можна виявити методом посіву; визначити ступінь токсичності та фактори вірулентності; вивчити ефективність протимікробних і імунологічних препаратів; експериментально відтворити деякі інфекції (інфекційний процес).

Завдання 2. Виявлення факторів вірулентності бактерій.

Принцип дослідження. Базується на виявленні ферментів, як факторів вірулентності патогенних мікроорганізмів, шляхом посіву на спеціальні середовища.

Хід роботи: а) виявлення бактеріальних гемолізинів. Штам стафілококу №1, виділений від хворого ангіною , штам №2 – зі шкіри здорової людини. Обидва штами пересіяні на тверде середовище з вмістом 3% еритроцитів кроля. Визначити який із штамів продукує гемо лізини;

б) визначення лецитиназної активності бактерій. Обидва штами стафілококів посіяно на тверде середовище з яєчним жовтком. Виявити лецитиназно-позитивний штам;

в) виявлення плазмокоагулази у бактерій. Колонії штамів №1 та №2, що виросли при температурі 37⁰С протягом 12 год., засіяно у пробірки з цитратною кролячою плазмою. Пробірки витримано в термостаті при температурі 37⁰С протягом 4 год. Встановити, який із цих штамів є плазмокоагулюючим;

г) визначення бактеріальної гіалуронідази. У 6 пробірок внесено робочу дозу гіалуронової кислоти по 0,2 мл., дистильовану воду і фільтрат бульйоної культури за схемою:

Пробірки	1	2	3	4	5	6
Гіалуронова кислота	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Дистильована вода	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8
Фільтрат бульйонної культури стафілокока	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1	_

Після витримування пробірок у термостаті протягом 15 хв., а потім у холодильнику протягом 2 хв. у кожну з них внесено по 2 краплі 2% розчину оцтової кислоти. Встановити за ступенем руйнування гіалуронової кислоти гіалуронідазну активність вказаних штамів стафілококів. Зробити висновок про патогенність досліджуваних штамів стафілококів.

Практичне значення. Додаткове дослідження факторів вірулентності допомагає встановити вид збудника та міру його патогенності.

Завдання 3. Вивчення капсулоутворення бактерій в організмі тварин.

Принцип дослідження. Виявлення відповідної структури у мікроорганізмів при мікроскопічному дослідженні

Приготування та мікроскопування мазків з рідкого середовища та з трупа тварини, яка була заражена капсульними бактеріями.

Хід роботи: Дослідити мікроскопічно 2 мазки: 1) мазок №1 – приготований із бульйонної культури пневмокока; 2) мазок №2 - відбиток органів тварини, що загинула після зараження культурою пневмокока. Обидва мазки забарвленні метиловим синім. Мікроскопічна картина: в мазку №1 ланцетоподібні диплококи голубого кольору, в мазку №2 - на фоні овальних клітин органу, забарвлених у голубий колір, видно голубі ланцетоподібні диплококи, оточенні безколірною капсулою.

Практичне значення. Виявлення капсули у бактерій з трупного матеріалу вказує на їхню вірулентність, без капсульні варіанти тих самих видів невірулентні.

Завдання 4. Визначення ДЛМ (мінімальна летальна доза) дифтерійного токсину патогенних мікроорганізмів.

Принцип дослідження. Полягає у встановленні мінімальної кількості токсину, що вбиває чутливих тварин стандартної маси і віку протягом певного проміжку часу (загиблих тварин має бути не менше 95%).

Хід роботи: Вирахувати ДЛМ дифтерійного токсину для морської свинки, користуючись числовими результатами досліду.

Кількість введеного токсину (1:1000)	0,4мл	0,2мл	0,1мл	0,05мл	0 (конт-роль)
Строк загибелі тварин	2- й день	3- й день	4- й день	жива	жива

Практичне значення. Полягає у виявленні мікроорганізмів з високою вірулентністю, які можуть викликати захворювання і смерть у дуже мізерних дозах.

Завдання 5. Вивчення механізмів передачі інфекційних хвороб.

Принцип дослідження. Полягає у засвоєнні способів зараження відповідним видом інфекції, а також способів проникнення та поширення патогенних мікроорганізмів в організм людини.

Хід роботи: скласти таблицю “ Резервуари, джерела, механізми та шляхи передачі інфекції”.

Практичне значення. Розуміння елементів епідемічного процесу необхідно для вибору матеріалу для проведення мікробіологічних досліджень (клінічний матеріал, переносники, фактори передачі, тощо).

Складання протоколів: Записати результати біохімічної активності виділеної чистої культури (завдання 1). Заповнити таблицю, записати висновок про вид виділеної чистої культури, вказавши критерії, за якими вона ідентифікована (завдання 2). Записати зміст робіт та зробити відповідні висновки (завдання 3, 4), Скласти таблицю (завдання 5).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-C.50-51, 54-55, 63-64.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2004.-C.53-54, 661-662.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. - С.65-71.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Т.: Укрмедкнига, 2004. - С. 64-70,100-111.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П.,2002.- C. 124-135.

6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія / За редакцією В.П. Широбокова. – В.: Нова книга, 2011. – с. 61-63, 77-95, 177-194, 324.