Заняття 10.

Тема: Імунітет. Види резистентності організму до збудників інфекційних захворювань. Фактори неспецифічного захисту організму. Імунна система організму.

Актуальність. Людину оточує величезна кількість різноманітних біологічних об’єктів (мікроорганізмів, речовин) чужорідних до її організму, тож еволюційно у неї розвилися різні засоби та механізми захисту проти цих сторонніх агентів, які у сукупності називаються резистентністю організму. Розуміння механізмів першої лінії захисту організму від інфекції (неспецифічна реакція) та другої лінії захисту - імунологічні фактори, необхідне при дослідженні патогенетичних основ будь-якого захворювання.

Мета і завдання. Засвоїти основні знання про: механізми, фактори неспецифічної резистентності організму людини; показники оцінки неспецифічного захисту організму; органи та клітини імунної системи.

Контрольні питання.

1. Визначення поняття “імунітет”. Види імунітету.

2. Фактори і механізми неспецифічного імунного захисту організму.

3. Клітинно-тканинні механізми: бар’єрні та антимікробні властивості шкіри та слизових оболонок, рідин організму; нормальна мікрофлора тіла, запалення, лихоманка.

4. Фагоцитоз. Фагоцитуючі клітини. Стадії фагоцитозу. Завершений та незавершений фагоцитоз. Опсоніни.

5. Оцінка неспецифічної резистентності організму (фагоцитарне число, показник завершеності фагоцитозу, кількість активних фагоцитів, абсолютний фагоцитарний показник, опсоно-фагоцитарний індекс). Методи визначення.

6. Кілінгова система організму людини. Природні кілери та їх роль в імунному нагляді. Реакції відторгнення трансплантату.

7. Гуморальні механізми неспецифічного захисту: система комплементу, лізини, інтерферони, лізоцим, пропердин, фібронектин, бета-лізин, еритрин.

8. Центральні органи імунної системи, їх будова та функції.

9. Периферійні органи імунної системи, їх будова та функції.

10. Генез імунокомпетентних клітин.

11. Характеристика Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій.

12. Характеристика В-лімфоцитів та їх популяцій.

13. Макрофаги та їх функції.

Практичні навики.

Навчитись: виявляти клітини-фагоцити; досліджувати активність лізоциму слини та визначати титр комплементу; оцінювати стан неспецифічного імунного захисту за: розрахунком фагоцитарного числа, опсоно-фагоцитарного індексу, завершеністю фагоцитозу.

Тестові завдання.

1. В тексті завдання вказані фактори, що беруть участь у формуванні стійкості організму до патогенних мікрорганізмів. 1. Фагоцитоз. 2. Система комплементу. 3. Антитіла. 4. Лізоцим. 5. Імунні Т-кіллери. 6. Сенсибілізовані Т-лімфоцити. 7. Трансформовані під впливом антигену В-лімфоцити. Які з них відносяться до факторів неспецифічної резистентності?

А. 1, 2, 4

В. 2, 6, 7

С. 1, 4, 6

D. 3, 5, 7

E. 2, 4, 6

2. Як називається здатність організму протистояти дії генетично чужих субстанцій за допомогою механізмів, що виробилися конкретним видом в процесі еволюції?

А. Неспецифічна резистентність

В. Імунологічна реактивність

С. Імунологічна пам’ять

D. Імунологічний нагляд

Е. Імунологічна толерантність

3. Яка клітина імунної системи є центральною?

А. Еритроцит

В. Моноцит

С. Нейтрофіл

D. Лімфоцит

Е. Лейкоцит

4. Виберіть центральний орган імунної системи:

А. Селезінка

В. Кров

С. Вилочкова залоза

D. Печінка

Е. Лімфатичний вузол

5. З яких клітин походять лімфоцити?

А. Еритроцитів

В. Епітеліальних

С. Стовбурових

D. Ентероцитів

Е. Фагоцитів

Ситуаційна задача.

В хірургічний кабінет поліклініки звернувся пацієнт з підвищеною температурою тіла та нагноєною раною на лівому передпліччі. При огляді лікар відмітив набряк, почервоніння та болючість ураженої ділянки руки. Ним було забрано гній для мікроскопічного дослідження. А. Описати мікроскопічну картину препарату. В. Які механізми беруть учать у неспецифічному захисті організму? С. Які фактори захисту діють в означеному випадку?

Приклади тестів «Крок 1».

1.Для прискорення загоєння рани слизової оболонки в ротовій порожнині хворому призначено препарат, який являє собою термостабільний білок, що міститься у людини в сльозах, слині, грудному молоці, а також його можна виявити в свіжознесеному курячому яйці. Відомо, що він являє собою фактор природної резистентності організму і має назву:

A.*Лізоцим

B. Комплемент

C. Інтерферон

D. Інтерлейкін

E. Іманін

2. При обстеженні хворого була виявлена недостатня кількість імуноглобулінів. Які з перелічених клітин імунної системи виробляють імуноглобуліни?

А. *Плазматичні

В. Т-хелпери

С. Т-кілери

D.Т-супресори

Е. Плазмобласти

Зміст і хід заняття:

Робота 1. Вивчення видів резистентноті організму до збудників інфекційних хвороб.

Хід роботи. Розглянути за допомогою демонстраційних таблиць види імунітету.

Практичне значення. Вивчення ознак імунної відповіді того чи іншого типу використовується в діагностиці, лікуванні та профілактиці інфекційних захворювань.

Робота 2. Вивчення явища фагоцитозу.

Принцип роботи. Мікроскопічне дослідження гною, виділень від хворого дозволяє виявити фагоцити та фагоцитовані і нефагоцитовані клітини.

Хід роботи. Вивчити фази фагоцитозу: таксис (наближення лейкоциту до мікроорганізму); адсорбція (осідання мікроба на лейкоциті); проникнення (захоплення мікроба лейкоцитом); лізис (розчинення мікроорганізму в лейкоциті) та незавершений фагоцитоз, використовуючи демонстраційні таблиці. Розглянути таблиці із зображенням незавершеного фагоцитозу туберкульозних та бруцельозних бактерій. Мікроскопіювати в імерсійній системі мазки гною із уретри хворого на гонорею. Мікроскопічна картина: скупчення диплококів у лейкоцитах.

Практичне значення. Дослідження гною та виявлення фагоцитів свідчить про запальний процес активного клітинного неспецифічного захисту організму.

Робота 3. Оцінка фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів.

Принцип оцінки бактерицидної активності фагоцитів полягає у виявленні життєздатність бактерій, які після фагоцитозу опиняються в цитоплазмі лейкоцитів (незавершений фагоцитоз) та кількісні показники за підрахунком фагоцитуючих клітин.

Хід роботи. Суспензію культури стафілококу та суспензію нейтрофільних гранулоцитів крові змішують в 2-х пробірках та інкубують одну пробірку при 37⁰С протягом 30 хв., іншу – 120 хв. Після закінчення контакту фагоцитів з тест-культурою вміст пробірок центрифугують, з осаду готують препарати-мазки, фарбують їх за Папенгеймом та мікроскопіюють. Підраховують 200 клітин і визначають відсоток тих, що містять мікробні тіла – фагоцитарний індекс (ФІ). Підраховують фагоцитарне число (ФЧ) – середня кількість поглинутих мікробних тіл одним активним нейтрофілом. Вираховують індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ).

Практичне значення. Вивчення показників фагоцитозу має значення в комплексному аналізі діагностики імунодефіцитних станів: часторецидивуючі гнійні запальні процеси, тривалонезаживаючі рани, схильність до післяопераційних ускладнень. Вони допомагають в діагностиці вторинних імунодефіцитних станів, а також дозволяють спрогнозувати перебіг хвороби.

Показник фагоцитарного індексу в нормі - 40-80%. Фагоцитарне число в нормі складає 3-9. Індекс завершеності фагоцитозу значно більший одиниці свідчить про завершений фагоцитоз, а менший або рівний одиниці – незавершений

Робота 4. Оцінка фагоцитарної активності лейкоцитів периферійної крові людини з використанням мікроорганізмів, мічених флюорохромами.

Принцип методу. Фагоцит, який захопив мікроорганізми, помічені зеленим флюорохромом ФІТЦ, сам починає інтенсивно флуоресціювати. При цьому він чітко відрізняється від фагоцитів, які не поглинули мікроорганізми. Виходячи із означеного, вираховується фагоцитарний індекс.

Хід роботи. В пластикову пробірку вносять 10 мкл міченого стафілококу або кишкової палички в концентрації 200 млн./мл або 10 мкл мічених дріжджів в концентрації 80 млн./мл, додають 90 мкл цільної гепаринізованої крові, старанно перемішують та інкубують 30 хв. при 37⁰С. Далі вносять 2 мл охолодженого лізуючого розчину на 10 хв. (до повного лізису еритроцитів). Лейкоцити осаджують, відмивають і ресуспендують.

Для вивчення опсонуючої активності сироватки у зразки додають 20 мкл інтактної або прогрітої при 56⁰ С автологічної сироватки. Як контроль опсонізації можна використовувати суміш сироваток від здорових людей.

Після проведення реакції для мікроскопії готують препарати типу висушена крапля, розглядають і підраховують фагоцитарний індекс, використовуючи фазово-контрастну і люмінесцентну мікроскопію.

Практичне значення. Фагоцитарна активність нейтрофілів є однією із найбільш важливих їх функціональних характеристик.

Робота 5. Оцінка завершеності фагоцитозу.

Принцип методу. Мікроорганізми, мічені зеленим флюорохромом ФІТЦ, інтенсивно флуоресціюють, що буде в результаті їх відрізняти від мертвих клітин, які в свою чергу будуть зафарбовані пропідіумом йодидом.

Хід роботи. Мікроорганізми мітять ФІТЦ та зберігають свою життєздатність. Ставлять реакцію поглинання мічених мікроорганізмів фагоцитами. Непоглинуті частинки видаляють і навантажені лейкоцити інкубують для здійснення реакції внутрішньоклітинного кілінгу. Після цього фагоцити руйнують. Мікроорганізми, які залишилися, дофарбовують пропідіуму іодидом, який проникає тільки у мертві клітини. Таким чином, зелена флюоресценція ФІТЦ відрізняє мікроорганізми від клітинного детриту (уламків та ядер лейкоцитів), а пропідіуму іодит служить для визначення відсотку вбитих мікроорганізмів.

Практичне значення. Даний тест дозволяє виявити спадкові дефекти кілінгу мікроорганізмів (хронічну гранулематозну хворобу у дітей, дефіцит мієлопероксидази) і дріжджів (відсутність експресії манозного рецептору, вроджені Т-клітинні імунодефіцити), вторинні імунодефіцити, які супроводжуються важкими (сепсис) та рецидивуючими гнійними інфекціями (фурункульоз, піодермія), стани після хіміо- та променевої терапії.

Робота 6. Визначення титру лізоциму в крові.

Принцип методу. В основі лежить здатність лізоциму лізувати тест-мікроби, внаслідок чого в пробірках буде відсутнє помутніння.

Хід роботи. Приготувати двократні розведення сироватки крові. Для цього в 7 пробірок налити по 0,5 мл фізіологічного розчину, у першу внести 0,5 мл сироватки, перемішати і перенести 0,5 мл у другу пробірку, одержавши розведення 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32, 1 : 64. Із шостої пробірки 0,5 мл розчину вилити. Сьома пробірка - контрольна, до неї сироватку не вносять. У всі пробірки внести по 0,5 мл суспензії тестової культури Місrococcus lysodeiticus і поставити в термостат на 1 год. Облік реакції: відмітити у яких пробірках відсутній ріст тестової культури і встановити титр лізоциму.

Практичне значення. Визначення активності лізоциму є одним із показників неспецифічного захисту організму, зокрема, активності місцевого захисту.

Робота 7. Визначення титру комплементу.

Принцип методу. Рівень комплементу у сироватці крові визначають за допомогою реакції гемолізу. У цій реакції еритроцити барана є антигенами, а антитіла містяться в гемолітичній сироватці, яку одержують при імунізації кролів еритроцитами барана. При взаємодії антитіл з антигенами еритроцитів активується комплемент і наступає лізис еритроцитів (гемоліз).

Хід роботи. Внести в пробірки гемолітичну сироватку й еритроцити, додати різну кількість (від 0,1 до 0,9 мл) досліджуваної сироватки. Культивувати в термостаті 30 хвилин при 37⁰С. Визначити титр комплементу – найбільше розведення сироватки, яка забезпечує повний гемоліз еритроцитів.

Практичне значення. Показники активності комплементу сироватки крові використовують при оцінці імунного статусу організму, як центральної ефекторної ланки імунного захисту та неспецифічних захисних реакцій.

Робота 8. Вивчення органів імунної системи та їх функції.

Хід роботи. Вивчити за допомогою демонстраційних схем та навчальних таблиць органи імунної системи та їх функції.

Практичне значення. Лімфоїдні органи і тканини, які об’єднані морфологічно і функціонально, складають імунну систему. В них відбувається утворення клітин-попередників усіх популяцій лімфоцитів, макрофагів, еритроцитів, гранулоцитів, моноцитів; дозрівання лімфоцитів, їх лімфопоетична диференціація, набуття ними імунної компетенції; розмноження та нагромадження Т- і В-лімфоцитів, тощо.

Робота 9. Вивчення клітин імунної системи та їх функцій.

Хід роботи. Вивчити за допомогою демонстраційних схем та навчальних таблиць клітини імунної системи та їх функції. Розглянути по мікроскопом препарати-мазки крові. Виявити лімфоцити (макрофаги, моноцити). Звернути увагу на їх будову та відмінність від інших клітин.

Практичне значення. Розуміння функції окремих популяцій клітин імунної системи необхідне для правильної діагностики, патогенетичного, етіотропного лікування та профілактики інфекційних хвороб.

Складання протоколів. Намалювати: схему видів імунітету (робота 1), схему та мікроскопічну картину препаратів (робота 2). Описати методику визначення фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів. Розрахувати опсоно-фагоцитарний індекс (робота 3). Описати принцип постановки дослідів (роботи 4, 5, 6, 7). Описати: органи і клітини імунної системи та їх функції (роботи 8, 9).

Література.

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.215 - 235.

2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.183 - 186, 194-200.

3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.139 - 147.

4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 156 - 157.

5. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.18-45, 78-91, 101-102, 230-235.

6. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 148 - 187.

7. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С.26 - 28.

8. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.194 - 209.

9. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.5-10.

10. Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.40-70, 138-149, 165-205, 300-327.