Лабораторная Диагностика / учебное пособие по лаб д / Руководство по лаб. методам диагностики A.A.Кишкун

Серологические исследования ■ 473

Рис. 8-11. Алгоритм обследования пациентов с подозрением на инфекционный мононуклеоз.

циентов. На рис. 8-11 приведён алгоритм использования серологических тестов у больных с симптомами острого мононуклеоза.

Цитомегаловирусная инфекция

ЦМВ-инфекция — вирусное заболевание преимущественно детей раннего возраста, характеризующееся многообразием клинической симптоматики и специфической морфологической картиной с присутствием цитомегалических клеток на фоне лимфогистиоцитарных инфильтратов. Возбудитель инфекции принадлежит к семейству Herpesviridae (вирус герпеса человека тип 5). Особенности ЦМВ: крупный ДНК-геном (диаметр нуклеокапсида 100−120 нм), возможность репликации без повреждения клеток, медленная репликация, сравнительно низкая вирулентность, резкое угнетение клеточного иммунитета. Как и другие вирусы этого семейства, ЦМВ способен вызывать персистентную и латентную инфекцию и реактивировать-

474 ■ Глава 8

ся в условиях ослабления иммунитета. ЦМВ распространён повсеместно. От 0,5% до 2,5% новорождённых инфицируются им в период внутриутробного развития.

Характер поражения плода зависит от сроков инфицирования ЦМВ. Заражение в ранние сроки беременности приводит в части случаев к внутриутробной гибели плода и выкидышам, мертворождениям, рождению детей с пороками развития (например, сужение лёгочного ствола и аорты, дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородок, фиброэластоз миокарда, микроцефалия, гипоплазия лёгких, атрезия пищевода, аномалии строения почек и др.). При заражении в поздние сроки беременности пороки развития не формируются. Однако с первых дней после рождения у ребёнка выявляют желтуху, гепатоспленомегалию и геморрагический синдром. Отмечают поражение и других органов и систем: лёгких (интерстициальная пневмония), ЦНС (гидроцефалия, менингоэнцефалит), ЖКТ (энтерит, колит, поликистоз поджелудочной железы), почек (нефрит).

При интранатальном и раннем постнатальном инфицировании клинические признаки заболевания выявляют в первые 1−2 мес после рождения.

ЦМВ поражает многие типы клеток крови и может персистировать в моноцитах, макрофагах, мегакариоцитах, что в части случаев приводит к тромбоцитопении.

Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции основана на выявлении специфических АТ в сыворотке крови инфицированных или ДНК вируса в биологических жидкостях организма (например, кровь, слюна, моча, эякулят, пунктаты печени, лимфатических улов) методом ПЦР, а также Аг вируса в лимфоцитах мазка периферической крови методом непрямой иммунофлюоресценции (быстрый и чувствительный метод).

Антитела к цитомегаловирусу класса IgM и IgG в сыворотке крови

АТ IgM к ЦМВ в сыворотке крови в норме отсутствуют.

В серологической диагностике ЦМВ-инфекции используют много реакций, однако по-настоящему полезны те из них, которые могут выявить АТ, относимые к классам IgM и IgG. В последнее время наиболее широко применяют метод ИФА.

АТ к ЦМВ класса IgM появляются в течение 1−2 нед после начала заболевания и свидетельствуют о свежем инфицировании или реактивации латентной и персистентной инфекции. Однако следует иметь в виду, что у части больных повышения содержания АТ класса IgM может не происходить в течение первых 4 нед после начала заболевания. Повышенное содержание АТ класса IgM к ЦМВ может сохраняться в течение 12 мес у 24% пациентов. Наличие АТ IgM у беременных — показание для кордоцентеза и исследования крови плода на наличие АТ класса IgM. При наличии АТ IgM плод считают инфицированным. При врождённой ЦМВ-инфекции титр АТ IgM высокий, постепенно он снижается, на 2-м году жизни ребёнка они могут отсутствовать. При оценке результатов выявления АТ IgM следует учитывать, что наличие ревматоидного фактора может привести к ложноположительным результатам исследования.

АТ к ЦМВ класса IgG появляются через 2−4 нед после заражения, у переболевших сохраняются до 10 лет. О наличии инфекции свидетельствует

Серологические исследования ■ 475

только 4-кратное и более увеличение титра АТ IgG при исследовании парных сывороток. Частота выявления АТ класса IgG может достигать 100% среди различных групп населения.

Группу наибольшего риска для ЦМВ-инфекции составляют лица с искусственной или естественной иммуносупрессией: ВИЧ-инфицированные, реципиенты органов, тканей, клеток, онкологические больные.

Выявление АТ IgM и IgG к ЦМВ используют для диагностики острого периода ЦМВ-инфекции, в том числе при иммунодефицитных состояниях, ВИЧ-инфекции, лимфопролиферативных заболеваниях и определении периода реконвалесценции ЦМВ-инфекции.

Корь

Возбудитель кори (morbilla) — относят к классу РНК-вирусов. Заболевают корью чаще дети дошкольного возраста. Однако лица, не болевшие корью, остаются высоко восприимчивыми к ней в течение всей жизни и могут заболеть в любом возрасте. Для экспресс-диагностики кори используют обнаружение Аг в клетках отделяемого носоглотки или кожи (из элементов сыпи) методом иммунофлюоресцентной микроскопии (в реакции применяют меченый флюорохромом коревой IgG). Дополнительным подтверждением инфекции может служить обнаружение многоядерных клеток в отделяемом носоглотки или мазках-отпечатках после окраски по Романовскому−Гимзе или Павловскому. Выявление АТ к возбудителю кори осуществляют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), РСК, РПГА и ИФА.

Антитела IgM и IgG к вирусу кори в сыворотке крови

АТ IgM к вирусу кори в сыворотке крови в норме отсутствуют. Серологические методы исследования применяют для подтверждения

диагноза, особенно стёртых, атипичных форм. Наиболее часто используют РТГА и РСК. Специфическая диагностика ретроспективна, поскольку в этих реакциях учитывают нарастание титра АТ в парных сыворотках. Первую пробу крови берут не позже 3-го дня периода высыпаний, вторую — через 10−14 дней. Диагноз считают верифицированным только при нарастании титра АТ в 4 раза и более. При применении метода ИФА выявляют АТ классов IgM и IgG.

АТ IgM обнаруживают в острый период инфекции (в течение 6 дней после появления сыпи — у 80%, через 7 дней — у 95% пациентов), они достигают пика концентрации через 2−3 нед, держатся в течение 4 нед и затем постепенно исчезают (50% пациентов становятся серонегативными через 4 мес). АТ IgG появляются в период реконвалесценции, у переболевших сохраняются до 10 лет. Обнаружение АТ IgG в конце острого периода заболевания — прогностически благоприятный признак. Выявление в сыворотке крови АТ IgM или возрастание уровня АТ IgG в парных сыворотках более чем в 4 раза указывает на текущую инфекцию. Ложноположительные результаты определения АТ IgM можно получить при хроническом активном гепатите, СКВ, инфекционном мононуклеозе.

Определение титра АТ IgG применяют для ретроспективной диагностики кори и оценки напряжённости противокоревого иммунитета.

476 ■ Глава 8

Вирусный паротит

Возбудитель эпидемического паротита относят к миксовирусам. Эпидемическим паротитом чаще болеют дети 3−10 лет. Основной метод лабораторной диагностики эпидемического паротита — выявление АТ класса IgM к вирусу паротита в сыворотке крови.

Антитела IgM к вирусу паротита в сыворотке крови

АТ IgM к вирусу паротита в сыворотке крови в норме отсутствуют.

Дети до 2 лет болеют эпидемическим паротитом редко, но затем заболеваемость возрастает и достигает пика к 5−9 годам. Диагностика эпидемического паротита основана на клинической картине заболевания. Серологическое подтверждение острой инфекции можно получить с помощью ИФА, позволяющего определять АТ класса IgM. АТ IgM появляются в острый период инфекции (на 2-й день заболевания их выявляют у 70% пациентов, к 5-му дню — у 100%) и сохраняются до 2 лет (у 50% пациентов — более 5 мес). Обнаружение в сыворотке крови АТ IgM или возрастание титра АТ IgG в парных сыворотках более чем в 4 раза (чувствительность 88%) указывает на текущую инфекцию.

РСК обладает меньшей чувствительностью и специфичностью. Для подтверждения диагноза необходимо проведение анализа парных сывороток. Нарастание титров в процессе заболевания в 4 раза и более считают диагностическим. При однократном исследовании диагностический титр составляет 1:80 и выше.

Краснуха

Краснуха (rubeola) — острое инфекционное антропонозное заболевание, передающееся воздушно-капельным путём. Возбудитель краснухи относят к семейству Togaviridae, роду Rubivirus. Вирионы содержат РНК. Для краснухи характерна зимне-весенняя сезонность заболеваемости. У 30−50% инфицированных краснуха протекает в бессимптомной форме.

У 15−50% женщин существует потенциальная опасность инфицирования краснухой во время беременности. Наибольшую опасность для потомства представляет наличие у беременных стёртых и латентных форм краснухи, сопровождающихся персистенцией возбудителя. Инфицирование плода вирусом краснухи в зависимости от срока беременности вызывает различные пороки его развития. При заражении женщины в первые 2 мес беременности у плода развиваются пороки сердца (открытый артериальный проток, стеноз лёгочной артерии и её ветвей, дефекты межпредсердной или межжелудочковой перегородки и др.), поражения органа зрения (катаракта, глаукома, ретинопатия). Инфицирование женщины на 3−4-м месяце беременности приводит к формированию пороков ЦНС (микроцефалия, паралич конечностей, нарушение психического развития) и поражению органа слуха (глухота, дефекты кортиева органа). Чем в более ранние сроки происходит заражение беременной, тем выше вероятность поражения плода и шире диапазон возможных аномалий развития. При заболевании женщины в первые 6 нед беременности частота врождённых аномалий у новорождённого составляет 56%, при инфицировании на 13−16-й неделе

478 ■ Глава 8

Рис. 8-13. Динамика основных маркёров краснухи.

Обнаружение АТ класса IgM используют для диагностики острого периода заболевания. После вакцинации АТ IgM обнаруживают через 15−25 дней

в60−80% случаев. При реинфекции содержание АТ IgM не повышается (необходимо исследовать динамику АТ IgG — 4-кратное увеличение титра

впарных сыворотках подтверждает диагноз). Низкую концентрацию АТ IgM можно обнаружить при инфекционном мононуклеозе и других вирусных ин-

фекциях (например, ЦМВ-инфекция, корь, герпетическая инфекция).

АТ класса IgG выявляют через 3 дня после появления высыпаний у 50% больных, через 8 дней — более чем у 90%, на 15−25-й день — почти у всех пациентов. У переболевших сохраняются АТ IgG до 10 лет и более. Определение титра АТ класса IgG используют также для оценки напряжённости поствакцинального иммунитета (появляются на 25−50-й день после вакцинации) и определения инфекции в анамнезе. Отсутствие АТ IgG у новорождённых исключает врождённую инфекцию. Динамика основных маркёров краснухи представлена на рис. 8-13.

При оценке вакцинации о её эффективности свидетельствуют значения для ИФА: содержание АТ класса IgG выше 15 МЕ/л.

Грипп

Возбудители гриппа относят к семейству ортомиксовирусов, роду Influenzavirus, включающему два вида вирусов гриппа: А и В. Вирусы гриппа содержат РНК и наружную оболочку, в которой размещены два Аг (гемагглютинин и нейрамидиназа), способных менять свои свойства, особенно у вируса гриппа типа А. Для диагностики заболевания используют метод иммунофлюоресценции (прямой и непрямой), позволяющий выяв-

Серологические исследования ■ 479

лять вирус гриппа в отделяемом из верхних дыхательных путей или мазках из носа (чувствительность — 58−100%, специфичность — 88−100%), а также выявление NP-Аг (нуклеопротеидного белка, ассоциированного с РНК) или М-протеина (основного белка вирусной частицы) вируса гриппа методом ИФА (чувствительность — 40−100%, специфичность — 52−100%).

Антитела к вирусу гриппа А и В в сыворотке крови

Для обнаружения АТ к вирусам гриппа применяют РСК или ИФА. При РСК исследование проводят в начале заболевания (1−2-й день) и через 5−7 дней, диагностическим считают нарастание титра АТ не менее чем

в4 раза при исследовании парных сывороток.

Метод ИФА отличается большей чувствительностью (по сообщениям

разных авторов, от 39% до 100%) и очень высокой специфичностью. Как и при РСК, для использования в диагностических целях ИФА необходимо сравнение содержания АТ в пробах сыворотки, полученных от больных

вначале и в конце заболевания.

Определение содержания АТ к вирусу гриппа А и В применяют для диа-

гностики острых респираторных вирусных инфекций, оценки напряжённости поствакцинального иммунитета, диагностики гриппа А и В.

Парагрипп

Известно четыре типа вирусов парагриппа (1, 2, 3, 4), их относят к РНКвирусам. Выделение вируса во внешнюю среду происходит в течение первой недели заболевания. Обнаружение вируса парагриппа в назофарингеальном отделяемом выполняют с помощью метода иммунофлюоресценции. Для выявления специфических АТ к вирусам в сыворотке крови используют РСК или ИФА.

Антитела к вирусу парагриппа типов 1, 2, 3 и 4

в сыворотке крови

При РСК исследование проводят в начале заболевания и через 5−7 дней, диагностическим считают нарастание титра АТ не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток. Однако даже при такой динамике АТ оценивать результаты исследования нужно с большой осторожностью, так как вирусы парагриппа и паротита имеют антигенное родство, поэтому возможно 4-кратное и более увеличение титра АТ к вирусам парагриппа

улиц после недавно перенесённого вирусного паротита.

По сравнению с РСК метод ИФА (позволяет выявлять АТ типов IgM

и IgG) отличается большей чувствительностью (по данным разных авторов, от 49% до 94%). Однако, как и при РСК, для использования в диагностических целях ИФА необходимо сравнение титров АТ в пробах сыворотки, полученных от больных в начале и в конце заболевания. Это обусловлено тем, что даже отдельное определение повышенного титра АТ IgM не позволяет однозначно подтвердить этиологический диагноз из-за гетерофильности этой группы АТ (дают перекрёстную реакцию с Аг других вирусов).

Определение АТ к вирусу парагриппа типов 1, 2, 3 и 4 применяется для диагностики острых респираторных вирусных инфекций, оценки напряжённости поствакцинального иммунитета, диагностики парагриппа.

480 ■ Глава 8

Аденовирусная инфекция

В настоящее время у человека выделено более 40 серотипов аденовирусов. Аденовирусные заболевания широко распространены как в виде спорадических случаев, так и в виде вспышек. Чаще всего болеют дети. Для этиологической диагностики заболевания применяют метод иммунофлюоресценции, позволяющий обнаруживать вирус в назофарингеальном отделяемом (клетках эпителия). В последние годы разработан быстрый (время анализа составляет 15 мин) иммунохроматографический тест на слайдах для обнаружения аденовируса в кале, обладающий чувствительностью 99% и специфичностью 91,6%.

Антитела к аденовирусам в сыворотке крови

Для обнаружения АТ к аденовирусам используют РСК или ИФА.

При РСК исследование проводят в начале заболевания и через 5−7 дней, диагностически значимым считают нарастание титра АТ не менее чем

в4 раза при исследовании парных сывороток.

Метод ИФА отличается высокой специфичностью, но низкой чувстви-

тельностью. Как и при РСК, для использования в диагностических целях ИФА необходимо сравнение титров АТ в пробах сыворотки, полученных от больных в начале и в конце заболевания.

Определение титров АТ к аденовирусам применяют для диагностики острых респираторных вирусных инфекций, оценки напряжённости поствакцинального иммунитета, диагностики аденовирусных инфекций.

Респираторно-синцитиальная инфекция

Респираторно-синцитиальным вирус относят к парамиксовирусам. Заболевание характеризуется преимущественным поражением органов дыхания (бронхиты, пневмонии). Респираторно-синцитиальным вирус — важнейший возбудитель респираторных заболеваний у детей младшего возраста и частая причина патологии нижних отделов дыхательных путей у новорождённых. Основным методом диагностики заболевания ранее служил метод иммунофлюоресценции (обнаружение вируса в назофарингеальном отделяемом). В последние годы разработан быстрый (время анализа составляет 10 мин) и простой в использовании иммунохроматографический тест на слайдах для обнаружения вируса в назофарингеальном отделяемом, обладающий сравнимой с методом иммунофлюоресценции чувствительностью (85,7%), но большей специфичностью (91,7%).

Антитела к респираторно-синцитиальному вирусу

в сыворотке крови

Для выявления АТ к респираторно-синцитиальному вирусу применяют РСК или ИФА.

При РСК исследование проводят в начале заболевания и через 5−7 дней, диагностически значимым считают нарастание титра АТ не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток, но этот метод исследования менее чувствителен у детей в возрасте до 4 мес.

Серологические исследования ■ 481

Метод ИФА отличается большей чувствительностью (70−100%). Как и при РСК, для использования в диагностических целях ИФА необходимо сравнение титров АТ в пробах сыворотки, полученных от больных в начале и в конце заболевания. Повышенные значения титров АТ при однократном исследовании могут указывать на ранее перенесённую инфекцию. Повторная инфекция сопровождается повышением титра АТ при исследовании в динамике.

Коксаки-инфекция

Вирусы Коксаки представлены двумя группами: группа Коксаки А, включающая 23 сероварианта (А1−А22,4), и группа Коксаки В, включающая 6 серовариантов (В1−В6). Вирусы Коксаки А и В вызывают у человека полиомиелитоподобные заболевания, у 20−40% больных в возрасте до 20 лет инфекция осложняется миокардитом. Существует некоторая связь между серовариантом вируса и характером клинических проявлений инфекции. Так, вирус Коксаки А16 вызывает поражение слизистой оболочки рта, парезы конечностей, Коксаки А24 — острый геморрагический конъюнктивит, Коксаки от В1 до В5 — перикардиты, миокардиты и молниеносный энцефаломиокардит. Для диагностики Коксаки-инфекции используют серологические методы — РСК, РТГА и реакцию нейтрализации.

Антитела к вирусам Коксаки в сыворотке крови

При использовании РСК, РТГА и реакции нейтрализации выявляют АТ в сыворотке крови. Исследуют парные сыворотки в острый период инфекции и через 2−3 нед от начала болезни. В пользу инфекции свидетельствует увеличение титра АТ не менее чем в 4 раза. Следует отметить, что такие изменения титра удаётся выявить очень редко, поэтому оценка результатов исследований вызывает большие затруднения. РСК позволяет выявить специфические АТ отдельно к каждому сероварианту вируса Коксаки В (от В1 до В6).

Инфекционная эритема

Инфекционная эритема — заболевание, вызываемое парвовирусом В19 (В19V). Эту инфекцию ещё называют «пятая болезнь» в добавление к четырём хорошо известным TORCH-инфекциям (toxoplasma, others, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex — токсоплазменная инфекция, краснуха, ЦМВ-инфекция, герпетическая инфекция). В зависимости от возраста пациента инфекционная эритема характеризуется различными симптомами: от эритематозной сыпи и лихорадки до тяжёлых форм артрита и лимфаденопатии. Инфекция передаётся воздушно-капельным путём (инкубационный период составляет около 7 дней), но инфицирование может произойти при переливании крови или через плаценту от беременной к плоду. Наиболее часто заболевают дети 4−11 лет, у взрослых инфекционная эритема протекает тяжело (особенно у женщин старше 30 лет). У беременных парвовирусная инфекция в I и II триместрах беременности вызывает водянку плода (в 5−10% случаев) и приводит к выкидышам и внутриутробной