Лабораторная Диагностика / учебное пособие по лаб д / Руководство по лаб. методам диагностики A.A.Кишкун

352 ■ Глава 7

■Осуществлять контроль за эффективностью иммунодепрессивной или иммуностимулирующей терапии.

■ Проводить типирование и подбор доноров при пересадке органов и контроль за проведением иммунодепрессивной терапии при трансплантациях.

■Проводить фенотипирование гемобластозов.

■Диагностировать генетическую предрасположенность к соматическим

заболеваниям.

Показаниями к назначению иммунологических исследований считают следующие заболевания и состояния.

■Подозрение на наличие генетически обусловленных дефектов иммунной системы (первичные иммунодефициты).

■Аутоиммунные заболевания.

■Аллергические состояния и заболевания.

■Инфекционные заболевания с затяжным и хроническим течением.

■Подозрение на наличие приобретённого иммунодефицита.

■Злокачественные новообразования.

■Проведение цитостатической, иммунодепрессивной и иммуномоделирующей терапии.

■Подготовка к серьёзным хирургическим вмешательствам и осложнённое течение послеоперационного периода.

■Обследование реципиентов до и после аллотрансплантации органов. Исследование иммунного статуса в настоящее время включает в себя

оценку следующих его компонентов:

■антигенспецифических (гуморальный и клеточный иммунитет);

■антигеннеспецифических (система неспецифической резистентности организма).

При этом антигенспецифические факторы включают гуморальный и клеточный иммунный ответ. Первый основан на выработке АТ, второй — на действии активированных тимусзависимых лимфоцитов (Т-лимфоцитов). Для иммунного ответа гуморального типа характерна выработка АТ, которые одновременно являются эффекторами В-звена иммунной системы. Для оценки этого звена используются исследования, которые характеризуют функциональную активность В-звена иммунитета и включают в себя определение концентраций Ig, уровня АТ после профилактической иммунизации, выявление ЦИК. Клеточный тип ответа характеризуется выработкой большого количества антигенспецифических активированных В- и Т-лимфоцитов. Оптимальный иммунный ответ реализуется только при взаимодействии гуморального и клеточного звеньев иммунитета.

Гуморальный иммунитет

Ig представляют собой характерный продукт секреции В-клеток на конечной стадии их дифференцировки, то есть плазматических клеток. Концентрация Ig в сыворотке крови отражает установившееся равновесие между их синтезом и распадом. Дефекты, связанные с нарушением метаболизма Ig, наблюдают при многих заболеваниях. Уменьшение содержания Ig в сыворотке крови может происходить по трем причинам:

■нарушение синтеза одного, нескольких или всех классов Ig;

■увеличение деструкции Ig;

Иммунологические исследования ■ 353

■ значительные потери Ig (например, при нефротическом синдроме). Общее следствие этих процессов — дефицит Ig и соответственно АТ.

При нарушении синтеза Ig нарушаются и реакции иммунного ответа клеточного типа, опосредованные Т-лимфоцитами. Увеличение количества Ig может быть обусловлено усилением их синтеза или уменьшением интенсивности их распада. Повышенная выработка Ig — причина гипергаммаглобулинемии.

IgA В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

IgA включают в себя два вида специфических белков: сывороточный и секреторный. IgA в сыворотке крови содержится в форме мономера (на 90% IgA1), входит в фракцию β-глобулинов и составляет до 15% Ig сыворотки крови. Секреторный IgA содержится в секретах (молоко, слюна, слёзная жидкость, секреты кишечного и респираторного тракта) и существует только в форме димера (IgA1 и IgA2). АТ класса IgA синтезируются, в основном, лимфоцитами слизистых оболочек в ответ на местное воздействие Аг, осуществляют защиту слизистых оболочек от патогенных микроорганизмов, потенциальных аллергенов и аутоантигенов. Связываясь с микроорганизмами, IgA АТ тормозят их адгезию к поверхности клеток эпителия и препятствуют проникновению во внутреннюю среду организма, предупреждая тем самым развитие местных воспалительных процессов. Локальный синтез IgA обусловливает местный иммунитет. Проникая во внутреннюю среду организма, IgA инактивирует бактерии и вирусы, активирует комплемент по альтернативному пути. Время полужизни IgA —6−7 сут.

У человека сывороточный IgA составляет менее 50% всего пула данного Ig. Референтные величины содержания IgA в сыворотке крови представлены в табл. 7-1 [Тиц Н, 1997].

Таблица 7-1. Референтные величины содержания IgA в сыворотке крови

Снижение концентрации IgA свидетельствует о недостаточности гуморального и местного иммунитета, нарушении синтеза или усилении катаболизма IgA, а также адсорбции его на иммунных комплексах. Изменения концентрации IgA при различных заболеваниях представлены в табл. 7-2.

Иммунологические исследования ■ 355

ную роль при бактериемии на ранних стадиях инфекции. Многовалентность этих АТ делает их особенно активными в реакциях агглютинации и лизиса. Снижение их содержания свидетельствует о недостаточности гуморального иммунитета, нарушении синтеза или усилении катаболизма IgM, а также адсорбции его на иммунных комплексах при воспалительных процессах. Изменения концентрации IgM в сыворотке крови при различных заболеваниях представлены в табл. 7-4.

Таблица 7-4. Изменения концентрации IgM в сыворотке крови при различных заболеваниях

IgG В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

IgG — основной компонент γ-глобулиновой фракции сыворотки крови. Они составляют основную часть всех Ig (80%) человека, являются важнейшими эффекторами гуморального иммунитета. Разнообразные АТ против бактерий, их токсинов, вирусов и других Аг относятся к IgG. Они содержатся не только в сосудистом русле, но и легко проникают в экстраваскулярное пространство, где осуществляют защитную функцию благодаря токсиннейтрализующей, вируснейтрализующей, опсонизирующей и бактерицидной активности. АТ этого класса — основной защитный фактор у ребёнка первых недель жизни (проникают через плацентарный барьер в кровь плода). Время полужизни — 21−24 дня. Активируют комплемент по классическому пути. Референтные величины содержания IgG в сыворотке крови представлены в табл. 7-5 [Тиц Н., 1997].

Снижение содержания IgG свидетельствует о недостаточности гуморального иммунитета. Изменения концентрации IgG в сыворотке крови при различных заболеваниях отражены в табл. 7-6.

356 ■ Глава 7

Таблица 7-5. Референтные величины концентрации IgG в сыворотке крови

Таблица 7-6. Изменения концентрации IgG в сыворотке крови при различных заболеваниях

ОБЩИЙ IgE В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

С IgE (реагинами) тесно связан механизм атопических аллергических реакций. Они обладают способностью к быстрой фиксации на клетках кожи, слизистых оболочек, тучных клетках и базофилах, поэтому в свободном виде IgE присутствует в плазме крови в ничтожных количествах. Время полужизни IgE — 3 дня в сыворотке крови и 14 дней на мембранах тучных клеток и базофилов. При повторном контакте с Аг (аллергеном) взаимо-

Иммунологические исследования ■ 357

действие реагиновых АТ и Аг происходит на поверхности базофилов и тучных клеток, что приводит к дегрануляции, высвобождению вазоактивных факторов (гистамина, серотонина, гепарина и др.) и развитию клинических проявлений анафилаксии. IgE обусловливает I тип гиперчувствительности немедленного типа — наиболее распространённый тип аллергических реакций. Помимо участия в аллергических реакциях I типа, IgE также принимает участие в защитном противогельминтном иммунитете. Референтные величины содержания общего IgE в сыворотке крови приведены в табл. 7-7.

Таблица 7-7. Референтные величины концентрации общего IgE в сыворотке крови

Определение содержания общего IgE в сыворотке крови применяют для диагностики атопических аллергических заболеваний (табл. 7-8).

Повышенную концентрацию IgE чаще выявляют у детей с аллергией и сенсибилизацией к большому количеству аллергенов. Частота выявления повышенного уровня IgE выше у больных детей с гиперчувствительностью к пищевым и пыльцевым аллергенам, чем у детей с гиперчувствительностью к домашней пыли и плесени.

Таблица 7-8. Основные болезни и состояния, сопровождающиеся повышением концентрации общего IgE в сыворотке крови

358 ■ Глава 7

У взрослых определение концентрации IgE в сыворотке крови имеет меньшее диагностическое значение, чем у детей. Повышенный уровень IgE выявляют только у 50% больных атопической бронхиальной астмой. Наиболее высокие значения концентрации IgE в крови отмечают при гиперчувствительности к большому количеству аллергенов в комбинации с бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и аллергическим ринитом. При гиперчувствительности к одному аллергену концентрация IgE может быть в пределах нормы.

Аллергический бронхопульмональный аспергиллёз сопровождается значительным повышением содержания IgE в крови. Его концентрация повышена почти у каждого больного с аллергическим аспергиллёзом в период острой лёгочной инфильтрации. Нормальный уровень IgE у больных с активным заболеванием лёгких позволяет исключить диагноз аспергиллёза.

Определение IgE имеет важное значение для диагностики редкого заболевания — гипер-IgE-синдрома. Он характеризуется повышением концентрации IgE в крови до 2000−50 000 кЕ/л, эозинофилией, резко выраженной крапивницей и гиперемией на вдыхаемые аллергены, пыльцу, пищу, бактериальные и грибковые аллергены. Бронхиальная астма для данного синдрома нехарактерна.

В табл. 7-9 приведены диапазоны содержания общего IgE в сыворотке крови (у взрослых) при некоторых патологических состояниях.

При оценке результатов определения общего IgE следует иметь в виду, что примерно у 30% больных с атопическими заболеваниями концентрация Ig может быть в нормальной.

Снижение содержания IgE в крови выявляют при атаксии−телеангиэктазии вследствие дефекта Т-клеток.

Таблица 7-9. Концентрация общего IgE в сыворотке крови при некоторых патологических состояниях [Тотолян А.А., 1998]

При постановке диагноза аллергии недостаточно констатации повышения концентрации общего IgE в крови. Для поиска причинного аллергена необходимо выявлять специфические АТ класса IgE. В настоящее время лаборатории в состоянии определять аллергенспецифический IgE в сыворотке к более чем 600 аллергенам, наиболее часто вызывающим аллергические реакции у человека. Тем не менее и обнаружение аллергенспецифического IgE (к какому-либо аллергену или Аг) ещё не доказывает, что именно этот аллерген ответствен за клиническую симптоматику. Интерпретацию результатов исследований следует проводить только после сопоставления с клинической картиной и данными подробного аллерголо-

Иммунологические исследования ■ 359

гического анамнеза. Отсутствие специфического IgE в сыворотке крови не исключает возможности участия в патогенезе заболевания IgE-зависимого механизма, так как местный синтез IgE и сенсибилизация тучных клеток могут происходить и в отсутствие специфических IgE в крови (например, при аллергическом рините). АТ других классов, специфичные для данного аллергена, особенно класса IgG, могут быть причиной ложноотрицательных результатов.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ИММУННЫЕ КОМПЛЕКСЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Содержание ЦИК в сыворотке крови в норме — 30−90 МЕ/мл.

ЦИК — комплексы, состоящие из Аг, АТ и связанных с ними компонентов комплемента С3, С4, С1q. В норме иммунные комплексы, образовавшиеся в кровотоке, фагоцитируются и разрушаются. При увеличении их размера (при избытке Аг и присутствии в их структуре IgM, компонента комплемента C1q) комплексы могут откладываться в периваскулярном пространстве и корковом слое почек, вызывая активацию комплемента и воспалительные процессы. Патологические реакции на иммунные комплексы могут быть обусловлены повышением скорости их образования над скоростью элиминации, дефицитом одного или нескольких компонентов комплемента или функциональными дефектами фагоцитарной системы. Определение содержания иммунных комплексов в сыворотке крови имеет важное значение в диагностике острых воспалительных процессов и аллергических реакций III типа, при которых уровень ЦИК повышается, а также при оценке эффективности проводимого лечения.

Приаутоиммунныхзаболеванияхпоявляютсяреагирующиестканямиаутоантитела, оказывающие цитотоксическое действие, однако несравненно больший повреждающий эффект оказывают иммунные комплексы. Описано более сотни болезней, преимущественно обусловленных депонированием в различных органах, тканях или системах ЦИК с последующей активацией комплемента и лизосом клеток, развитием воспалительной реакции или деструкции тканей под влиянием Т-киллеров и макрофагов.

Повышение концентрации ЦИК в крови возможно для следующих заболеваниях.

■Острых бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных инфекциях.

■Аутоиммунных заболеваниях, коллагенозах, ревматизме, гломерулонефрите, аллергических альвеолитах, васкулитах, феномене Артюса.

■Иммунокомплексных заболеваний, сывороточной болезни.

■Аллергических реакциях III типа.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Парапротеины в сыворотке крови в норме отсутствуют. Иммуноглобулинопатии, или гаммапатии, объединяют большую группу

патологических состояний, характеризующихся поликлональной или моноклональной гипергаммаглобулинемией. Ig состоят из двух тяжёлых (H) цепей (молекулярная масса 50 000) и двух лёгких (L) цепей (молекулярная масса 25 000). Цепи соединены дисульфидными мостиками и состоят из структур, которые называются доменами (Н — из 4, L —из 2 доменов). При действии протеолитических ферментов Ig разделяются на фрагмен-

360 ■ Глава 7

ты: Fc-фрагмент и Fаb-фрагмент. Тяжёлые цепи Ig человека представлены пятью структурными вариантами, которые обозначают буквами греческого алфавита: γ, α, μ, δ, ε. Им соответствуют 5 классов Ig — G, A, M, D, E. Лёгкие цепи представлены двумя структурно различными вариантами: κ (каппа) и λ (лямбда), которым соответствуют два типа Ig каждого класса. В каждой молекуле Ig обе тяжёлые и обе лёгкие цепи идентичны. У всех людей в норме присутствуют Ig всех классов и обоих типов, но их относительное содержание неодинаково. Соотношение молекул κ и λ в пределах разных классов Ig также неодинаково. Выявление нарушения соотношений Ig или их фрагментов играет важнейшую роль в диагностике моноклональных иммуноглобулинопатий.

Моноклональная иммуноглобулинопатия (парапротеинемия) — синдром, выражающийся в накоплении в сыворотке крови и/или моче больных однородных по всем физико-химическим и биологическим параметрам Ig или их фрагментов. Моноклональные Ig (парапротеины, М-протеины) — продукт секреции одного клона В-лимфоцитов (плазматических клеток), поэтому представляют собой пул структурно гомогенных молекул, имеющих тяжёлые цепи одного класса (субкласса), лёгкие цепи одного типа и вариабельные области одинакового строения. Моноклональные иммуноглобулинопатии принято разделять на доброкачественные и злокачественные. При доброкачественных формах моноклональных гаммапатий пролиферация плазматических клеток контролируется (возможно, иммунной системой) таким образом, что клинические симптомы отсутствуют. При злокачественных формах происходит бесконтрольная пролиферация лимфоидных или плазматических клеток, которая и обусловливает клиническую картину заболевания. Классификация моноклональных иммуноглобулинопатий приведена в табл. 7-10.

Таблица 7-10. Классификация моноклональных иммуноглобулинопатий

Иммунологические исследования ■ 361

Продолжение табл. 7-10

Иммуноэлектрофорез белков сыворотки крови позволяет выявлять моноклональные (патологические) IgA, IgM, IgG, цепи Н и L, парапротеины. При обычном электрофорезе нормальные Ig, разнородные по свойствам, располагаются в зоне γ, образуя плато или широкую полосу. Моноклональные Ig вследствие своей однородности мигрируют преимущественно в зону γ, изредка в зону β и даже в область α, где образуют высокий пик или чётко отграниченную полосу (М-градиент).

Множественная миелома (болезнь Рустицкого−Калера) — самый частый парапротеинемический гемобластоз; его выявляют не реже, чем хронические миело- и лимфолейкозы, лимфогранулематоз и острые лейкозы. Класс и тип секретируемых миеломой патологических Ig определяет иммунохимический вариант заболевания. Частота классов и типов патологических Ig при миеломе в целом коррелирует с соотношением классов и типов нормальных Ig у здоровых людей (табл. 7-11).

Наряду с повышением содержания патологических Ig в сыворотке больных множественной миеломой определяют нормальные Ig в сниженной концентрации. Содержание общего белка резко повышено — до 100 г/л. Активность процесса при G-миеломе оценивают по количеству плазмоцитов в стернальном пунктате, концентрации креатинина и кальция в сыворотке крови (их повышение кальция свидетельствует о прогрессировании заболевания). Концентрация М-протеина (в моче он называется белком Бенс−Джонса) служит критерием для оценки прогрессирования заболевания при А-миеломе. Концентрация парапротеинов в сыворотке и моче варьирует в течении болезни под воздействием терапии.

Для постановки диагноза множественной миеломы необходимо наличие следующих критериев [DeVita V.T. et al., 1989].

Большие критерии

1.Плазмоцитома по результатам биопсии.

2.Плазмоцитоз в красном костном мозге (более 30% клеток).

3.Пики моноклональных (патологических) Ig при электрофорезе сыво-

роточного белка: более 35 г/л для пика IgG или более 20 г/л для пика IgA. Экскреция κ- и λ-цепей в количестве 1 г/сут и более, выявленная с помощью электрофореза мочи у больного без амилоидоза.

Малые критерии

1.Плазмоцитоз в красном костном мозге 10−30% клеток.

2.Пик PIg в сыворотке крови в количестве меньшем, чем указано выше.

3.Литические поражения костей.

4.Концентрация нормального IgM ниже 0,5 г/л, IgA ниже 1 г/л или IgG ниже 0,6 г/л.