Лабораторная Диагностика / учебное пособие по лаб д / Руководство по лаб. методам диагностики A.A.Кишкун

442 ■ Глава 7

β2-Микроглобулин в сыворотке крови и моче

Референтные величины концентрации β2-микроглобулина: в сыворотке крови — 660−2740 нг/мл, в моче — 3,8−251,8 нг/мл. Период полужизни — 40 мин.

β2-микроглобулин — низкомолекулярный белок поверхностных Аг клеточных ядер. Присутствие его в сыворотке крови обусловлено процессами деградации и репарации отдельных элементов клеток. β2-Микрогло- булин свободно проходит через мембрану почечных клубочков, 99,8% его затем реабсорбируется в проксимальном отделе почечных канальцев. Уменьшение клубочковой фильтрации способствует повышению уровня β2-микроглобулина в сыворотке крови, нарушение функции почечных канальцев приводит к экскреции больших количеств β2-микроглобулина

смочой. Верхний предел реабсорбционной способности почечных канальцев достигается при концентрации β2-микроглобулина в сыворотке крови 5000 нг/мл. К состояниям, при которых повышается концентрация сывороточного β2-микроглобулина, относятся аутоиммунные заболевания, нарушения клеточного иммунитета (например, ВИЧ-инфекция), состояния после трансплантации органов. Повышение концентрации β2-микрогло- булина в ликворе у больных с лейкемией свидетельствует о вовлечении в процесс ЦНС. Определение β2-микроглобулина в крови и моче проводят больным при диагностике гломерулонефрита и канальцевых нефропатий, а также для выяснения прогноза у пациентов с неходжкинскими лимфомами и в особенности у пациентов с множественной миеломой (больные

сповышенной концентрацией имеют значительно более низкую продол-

жительность жизни, чем больные с нормальными значениями). Определение β2-микроглобулина необходимо для мониторинга лечения

гемобластозов, миеломы, контроля активации лимфоцитов при трансплан-

тации почки.

Концентрация β2-микроглобулина в крови повышается при почечной недостаточности, острых вирусных инфекциях, иммунодефицитах, в том числе ВИЧ-инфекции, аутоиммунных заболеваниях, гемобластозах (В-кле-

точных), миеломе, острых лейкозах и лимфомах с поражением ЦНС. Концентрация β2-микроглобулина в моче повышается при диабетичес-

кой нефропатии, интоксикации тяжёлыми металлами (соли кадмия).

Алгоритм исследования онкомаркёров

Специфичность опухолевых маркёров — процент здоровых лиц и больных с доброкачественными новообразованиями, у которых тест дает отрицательный результат.

Чувствительность онкомаркёра — процент результатов, которые являются истинноположительными в присутствии данной опухоли.

Пороговая концентрация (точка разделения) — верхний предел концентрации онкомаркёра у здоровых лиц и больных незлокачественными новообразованиями.

Факторы, влияющие in vitro на концентрацию онкомаркёров в крови

■Условия хранения сыворотки крови (нужно хранить в холоде).

■Время между забором образца и центрифугированием (не более 1 ч).

■Гемолизированная сыворотка крови (повышается концентрация НСЕ).

Иммунологические исследования ■ 443

■Контаминация образца (повышается концентрация РЭА и CA 19-9).

■Приём ЛС (повышают концентрацию ПСА аскорбиновая кислота, эстрадиол, ионы 2- и 3-валентных металлов, аналоги гуанидина, нитраты и др.).

Факторы, влияющие in vivo на концентрацию онкомаркёров в крови

■Продукция опухолью онкомаркёра.

■Выделение в кровь онкомаркёра.

■Масса опухоли.

■Кровоснабжение опухоли.

■Суточные вариации (необходимо взятие крови на исследование в одно и то же время).

■Положение тела в момент взятия крови.

■Влияние инструментальных исследований (рентгенография повышает концентрацию НСЕ; колоноскопия, пальцевое ректальное исследование — ПСА; биопсия — АФП).

■Катаболизм онкомаркёра (функционирование почек, печени, холестаз).

■Алкоголизм, курение.

Цели определения онкомаркёров в клинической практике

■Дополнительный метод диагностики онкологических заболеваний в комбинации с другими методами исследований.

■Ведение онкологических больных — мониторинг терапии и контроль течения заболевания, идентификация остатков опухоли, множественных опухолей и метастазов (концентрация онкомаркёра может быть

повышена после лечения за счёт распада опухоли, поэтому исследование следует проводить спустя 14−21 день после начала лечения).

■Раннее обнаружение опухоли и метастазов (скрининг в группах риска — ПСА и АФП);

■Определение прогноза заболевания.

Схема назначения исследований онкомаркёров

1.Определить уровень онкомаркёра перед лечением и в дальнейшем исследовать те онкомаркёры, которые были повышены.

2.После курса лечения (операции) исследовать через 2−10 дней (соответственно периоду полужизни маркёра) с целью установления исходного уровня для дальнейшего мониторинга.

3.Для оценки эффективности лечения (операции) провести исследование спустя 1 мес.

4.Дальнейшее изучение уровня онкомаркёра в крови проводить 1 раз

вмесяц в течение 1-го года после лечения, 1 раз в 2 месяца в течение 2-го года после лечения, 1 раз в 3 месяца в течение 3−5 лет (рекомендации ВОЗ).

5.Проводить исследование онкомаркёра перед любым изменением лечения.

6.Определять уровень онкомаркёра при подозрении на рецидив и метастазирование.

7.Определять уровень онкомаркёра через 3−4 нед после первого выявления его повышения.

Схема рационального использования онкомаркёров для диагностики онкологических заболеваний приведена в табл. 7-41.

444 ■ Глава 7

Таблица 7-41. Определение опухолевых маркёров

Примечание: 5 — высокая степень значимости маркёра для конкретной опухоли; 6 — средняя степень значимости для конкретной опухоли; 4 — дополнительный маркёр для конкретной опухоли.

Глава 8

Серологические исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие Аг и АТ. Серологические реакции используют в двух направлениях.

Первое направление. Обнаружение с диагностической целью АТ в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (АТ, Аг) неизвестными бывают составляющие сыворотки крови, так как постановку реакции проводят с заведомо известными Аг. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови АТ, гомологичных применяемому Аг; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании парных сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3−7-й день) и через 10−12 дней. В этом случае удаётся наблюдать динамику нарастания АТ. При вирусных инфекциях лишь четырёхкратное и большее повышение титра АТ во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода ИФА стало возможным определять в крови больных АТ, относимые к различным классам Ig (IgM и IgG), что существенно повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно АТ, относимые к IgM. Лишь позднее, на 8−12-й день после проникновения Аг в организм в крови начинают накапливаться АТ IgG. При иммунном ответе на инфекционные агенты происходит синтез также и АТ IgA, играющих важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

Второе направление. Установление родовой и видовой принадлежности микроорганизма. В этом случае неизвестным компонентом реакции становится Аг. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100% чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрёстные реакции с АТ, направленными к Аг других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учётом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Westernblot для подтверждения результатов скрининговых методов.

Сифилис

Сифилис — передающееся половым путём заболевание, которое вызывает бледная спирохета (Treponema pallidum). Заболевание начинается с появления безболезненной язвы в месте внедрения возбудителя (твёрдого шанкра) и регионарного лимфаденита. Через некоторое время инфекция

446 ■ Глава 8

становится генерализованной: развивается вторичный, а затем третичный сифилис. Классификация сифилиса приведена ниже.

Классификация сифилиса

■Первичный — развивается через 10−90 сут (в среднем через 21 сут) после заражения.

■Вторичный — развивается через 2−6 мес после заражения или на 2−10-й неделе после появления твёрдого шанкра.

■Латентный (скрытый) — стадия болезни, при которой серологические реакции положительны, а какие-либо признаки поражения кожи, слизистых оболочек и внутренних органов отсутствуют:

ранний латентный — менее 2 лет с начала заболевания;

поздний латентный — более 2 лет с начала заболевания;

неуточнённый латентный.

■Третичный — развивается через 3−7 лет после начала заболевания (от 2 до 60 лет), гуммы появляются через 15 лет.

■Врождённый.

Диагностика

Для диагностики сифилиса наиболее широко используют серологические методы, позволяющие обнаруживать иммунные нарушения (появление противосифилитических АТ) в организме больного в ответ на размножение

внём возбудителя заболевания.

Возникновение противосифилитических АТ при заболевании происхо-

дит в соответствии с общими закономерностями иммунного ответа: сначала происходит синтез АТ класса IgM, по мере развития болезни начинает преобладать синтез IgG. АТ IgM появляются на 2−4-й нед после заражения и исчезают у нелеченых больных примерно через 18 мес; при лечении раннего сифилиса — через 3−6 мес; позднего — через 1 год. АТ IgG появляются обычно на 4-й неделе после заражения и достигают более высоких титров, чем IgM. Они могут длительно сохраняться даже после клинического излечения больного.

Сифилитические АТ могут быть неспецифическими (реагины) и специфическими (противотрепонемными).

Для серо- и ликвородиагностики сифилиса возможно применение следующих методов.

■Микрореакция преципитации (МР) с кардиолипиновым Аг — отборочный тест, используемый при обследовании населения на сифилис. Постановку МР осуществляют с плазмой или инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL), РПР (RPR) и другие аналогичны МР как по принципу постановки реакции, так и по чувствительности и специфичности.

■ИФА (используют Аг из культуральных или патогенных бледных трепонем).

■Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Аг из культуральных или патогенных бледных трепонем.

■Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца.

Серологические исследования ■ 447

■Комплекс серологических реакций на сифилис, состоящий из РСК с трепонемным и кардиолипиновым Аг, и МР. Поскольку трепонемный Аг специфичен, комплекс серологических реакций относят к диагностическим тестам. В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоёмких реакций появилась возможность заменить РСК на ИФА или РПГА (также в сочетании с МР).

■Реакция иммобилизации бледных трепонем, в которой в качестве Аг используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ

Реакция микропреципитации с кардиолипиновым Аг на сифилис в норме отрицательная.

МР позволяет выявить АТ к кардиолипиновому Аг бледной спирохеты. МР при изолированном применении служит не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании её позитивности диагноз сифилиса не устанавливают, а пациенту проводят диагностические тесты (РСК, ИФА). С помощью МР обследуют лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на венерические заболевания, больных соматическими заболеваниями и др.

Существует несколько вариантов микрореакций — VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), RST (Reagin Screen Test), RPR (repid plasma reagin) и др. RPR-тест (МР плазмы с кардиолипиновым Аг) бывает положительной в 78% случаев при первичном, в 97% — при вторичном сифилисе. VDRL-тест (МР инактивированной сыворотки с кардиолипиновым Аг) положителен при первичном сифилисе в 59−87% случаев, при вторичном — в 100%, при позднем латентном — в 79−91%, при третичном — в 37−94% [Henry J.B., 1996]. МР обычно отрицательны в первые 7−10 дней после появления твёрдого шанкра.

В случае положительных результатов VDRL, RPR-тестов можно определить титр реагиновых АТ. Высокий титр (более 1:16) обычно указывает на активный процесс, низкий титр (менее 1:8) — на ложноположительный результат исследования (в 90% случаев), а также возможен при позднем или позднем латентном сифилисе.

Исследование титра АТ в динамике используют для оценки эффективности лечения. Снижение титра указывает на положительный ответ на проводимое лечение. Адекватное лечение первичного или вторичного сифилиса должно сопровождаться 4-кратным снижением титра АТ к 4-му месяцу и 8-кратным — к 8-му месяцу. Лечение раннего латентного сифилиса обычно приводит к концу года к отрицательной или слабоположительной реакции. Подъём титра в 4 раза указывает на рецидив, реинфекцию или неэффективность терапии и приводит к необходимости повторного курса лечения. При вторичном, позднем или латентном сифилисе низкие титры могут сохраняться у 50% пациентов дольше 2 лет, несмотря на снижение титра. Это не указывает на неэффективное лечение или реинфицирование, так как эти пациенты остаются серологически положительными, даже если повторить курс лечения. Следует учитывать, что изменения титров при позднем или латентном сифилисе часто непредсказуемы, оценка эффективности лечения по ним затруднительна.

448 ■ Глава 8

Чтобы отдифференцировать врождённый сифилис от пассивного носительства материнской инфекции, новорождённым необходимо провести серию исследований с определением титра АТ: подъём титра в течение 6 мес после рождения свидетельствует о врождённом сифилисе, в то время как при пассивном носительстве АТ исчезают к 3-му месяцу.

При оценке результатов VDRL и RPR-тестов у детей грудного возраста с врождённым сифилисом необходимо помнить о феномене прозоны. Сущность этого феномена состоит в том, что для агглютинации Аг и АТ в этих реакциях необходимо, чтобы Аг и АТ находились в крови в соответствующем количестве. Когда количество АТ значительно превышает количество Аг, агглютинации не происходит. У некоторых детей грудного возраста с врождённым сифилисом содержание АТ в сыворотке настолько велико, что в неразбавленной сыворотке не происходит агглютинации АТ и нетрепонемных Аг, используемых для диагностики сифилиса (тесты VDRL и RPR нереактивны). Поэтому у детей, обследуемых с целью диагностики врождённого сифилиса, возможен феномен прозоны. Во избежание ложноотрицательных результатов в таких случаях необходимо проводить исследования с разведением сыворотки и без него.

Микрореакция VDRL может быть негативной при раннем, позднем латентном и позднем сифилисе приблизительно в 25% случаев, а также у 1% больных вторичным сифилисом. В таких случаях необходимо использовать метод ИФА.

Ложноположительная реакция микропреципитации возможна при ревматических заболеваниях (например, СКВ, ревматоидный артрит, склеродермия), инфекциях (мононуклеоз, малярия, микоплазменная пневмония, активный туберкулёз, скарлатина, бруцеллёз, лептоспироз, корь, эпидемический паротит, венерическая лимфогранулёма, ветряная оспа, трипаносомоз, проказа, хламидиоз), беременности (редко), в старческом возрасте (около 10% людей в возрасте старше 70 лет могут иметь ложноположительную МР), при хроническом лимфоцитарном тиреоидите, гемобластозах, приёме некоторых гипотензивных средств, наследственной или индивидуальной особенности.

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Трепонемные АТ в сыворотке крови в норме не определяют.

РПГА на основе гелевой технологии используют для выявления специфических трепонемных АТ. Чувствительность и специфичность теста при первичном сифилисе составляет 76 и 99% соответственно, при вторичном — 100 и 99%, при позднем — 94 и 99%, при латентном — 97 и 99% [Wallach J.M.D., 1996]. РПГА применяют как подтверждающий тест на сифилис и для исключения ложноположительных результатов, полученных в МР.

Результаты исследования РПГА выражают в титрах, их можно использовать для оценки проводимого лечения, но они значительно уступают МР в этом аспекте. В РПГА используют сенсибилизированные эритроциты, поэтому ложноположительные результаты теста могут быть получены у больных с аутоиммунными заболеваниями (СКВ), вирусными инфекциями (вследствие наличия в сыворотке пациентов большого количества неспецифических АТ).

Серологические исследования ■ 449

РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Трепонемные АТ класса IgG в сыворотке крови в норме не определяют. РИФ (FTA-ABS IgG) относят к трепонемным тестам диагностики си-

филиса, она позволяет выявлять в крови специфические трепонемные АТ класса IgG. Чувствительность и специфичность теста при первичном сифилисе составляет 85% и 97% соответственно, при вторичном — 99% и 97%, при позднем — 95% и 97%, при латентном — 95% и 97%. FTA-ABS IgG используют для подтверждения диагноза, если есть подозрение на поздний сифилис любого типа, необходимо проводить этот тест даже в том случае, когда МР отрицательная. Титры АТ в РИФ не коррелируют с клинической активностью заболевания и остаются повышенными неопределённо долго у 95% пациентов, отражая наличие инфекции в прошлом. FTA-ABS IgG не используют для оценки проводимого лечения, так как тест остаётся положительным в течение 2 лет после адекватного лечения в 80% случаев серопозитивного раннего сифилиса. В настоящее время тест FTA-ABS IgG не рекомендуют применять для диагностики врождённого сифилиса у новорождённых.

Алгоритм диагностики сифилиса у небеременных, позволяющий исключить ложноположительные результаты исследований, представлен на рис. 8-1 [Wallach J.M.D., 1996].

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Трепонемные АТ класса IgM в сыворотке крови у здоровых людей не определяются.

Из всех серологических методов диагностики сифилиса метод ИФА наиболее чувствителен (свыше 95%) и специфичен (100%). При его использовании выявляют специфические (трепонемные) АТ классов IgM

иIgG. АТ класса IgM имеют большое значение для диагностики первичного, вторичного и врождённого сифилиса. Выявление АТ IgM свидетельствует о наличии у больного первичного, вторичного или врождённого сифилиса (рис. 8-2). АТ класса IgM выявляют в сыворотке крови со 2-й недели после заражения. В процессе лечения содержание АТ класса IgM у больного снижается. По их количеству можно следить за эффективностью проводимого лечения. После успешного лечения содержание АТ класса IgM снижается до отрицательных результатов. Определение АТ класса IgM имеет большое значение для диагностики ранних форм врождённого сифилиса, дифференциальной диагностики рецидивов, реинфекции. Тест на определение АТ IgM может быть отрицательным в некоторых случаях позднего латентного сифилиса и нейросифилиса. Определение АТ IgM методом ИФА имеет очень высокую чувствительность при врождённом сифилисе (100%)

иболее низкую — при первичном сифилисе (82%), вторичном (60%), латентном (53%), нейросифилисе (34%) и третичном сифилисе (11%) и очень высокую специфичность [Rich R.R. et al., 2001].

АТ класса IgG появляются в острый период заболевания и могут сохраняться у вылечившихся пациентов пожизненно. Согласно приказу Минздравмедпрома РФ № 286 «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путём» от 7 декабря 1993 г. в качестве специфического теста для подтверждения сифилиса вместо реакции иммобилизации бледных трепонем и РИФ рекомендуют использовать ИФА.

Серологические исследования ■ 451

Рис. 8-2. Появление классов АТ на различных стадиях сифилиса и способность различных скрининговых тестов дифференцировать стадии инфекции: 1 — антитрепонемный IgM; 2 — антитрепонемный IgG; 3 — антикардиолипиновые АТ

Метод ИФА применяют для диагностики сифилиса, дифференцирования ложноположительных результатов, полученных в МР, контроля за эффективностью лечения.

ВИЧ-инфекция

ВИЧ-инфекция — заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующим в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.

Возбудители — вирусы иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов — ВИЧ-1, ВИЧ-2, (HIV-I, HIV-2, Human Immunodeficiency Virus, types I, II) — относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы — сферические частицы диаметром 100−140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеины (структурные белки) с определённой молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 это gp 160, gp 120, gp 41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой — р17, р24, р55 (ВИЧ-2 содержит gp 140, gp 105, gp 36, р16, р25, р55).

Антитела к вирусу иммунодефицита человека в крови

АТ к ВИЧ 1/2 в сыворотке крови в норме отсутствуют.

Выявление АТ к вирусу иммунодефицита человека — основной метод лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В основе метода лежит ИФА (чувствительность — более 99,5%, специфичность — более 99,8%). АТ к ВИЧ появляются у 90−95% инфицированных в течение 3 мес после заражения, у 5−9% — через 6 мес, у 0,5−1% — в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество АТ может снижаться вплоть до полного исчезновения. При