6. Кофакторы. Существуют ферменты, для проявления

каталитических свойств которых необходимо присутствие кофакторов,

например, коферментов - производных витаминов, ионов металлов и

др.

Для определения оптимальной концентрации кофактора следует

построить кривую зависимости скорости реакции от концентрации

кофактора, аналогичную зависимости скорости реакции от

концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую

концентрацию кофактора.

После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо

проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [Р] от t.

Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в

частных статьях.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ РЕГИСТРАЦИИ

СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ

Скорость ферментативной реакции количественно можно измерить

по убыли субстрата или по образованию продукта реакции.

Предпочтительнее регистрировать скорость образования продукта,

поскольку это обеспечивает большую точность определения.

Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции

используют методы, связанные с отбором проб из реакционной смеси,

и регистрирующие методы, основанные чаще всего на спектральных

свойствах субстрата или продукта реакции.

Определение белка

Определение содержания белка в препарате проводят одним из

методов, приведенных в общей статье "Определение белка".

ЕДИНИЦЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Активность ферментов выражается в Международных единицах (ME)

или единицах действия (ЕД).

ME - это такое количество фермента, которое при заданных

условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1

мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в тех

случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле

субстрата).

ЕД - это условная единица, величина которой указывается в

частных статьях.

Нормируются:

Удельная активность препарата - выражается в единицах

ферментативной активности фермента (ME или ЕД) на 1 мг препарата и

на 1 мг белка (вторая величина характеризует чистоту препарата).

Доза выражается в единицах ферментативной активности (ME или

ЕД) на единицу лекарственной формы.

Определение активности ферментных препаратов

в сравнении со стандартным образцом

С целью снижения погрешности методов определения

ферментативной активности необходимо проводить определение

ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным

образцом. Стандартным образцом является высокоочищенный ферментный

препарат, качество которого отвечает требованиям соответствующей

нормативно - технической документации.

Определение ферментативной активности испытуемого препарата и

стандартного образца проводят в одинаковых условиях опыта.

Активность препарата (А) в соответствующих единицах (ME или

ЕД) вычисляют по формуле:

Ас х Пс х К

А = ---------------

Пр

где Ac - ферментативная активность стандартного образца в единицах

(ME или ЕД) на миллиграмм белка или препарата; Пс - величина

измеряемого параметра для стандартного образца; Пр - величина

измеряемого параметра для испытуемого препарата; К - коэффициент,

выравнивающий концентрации растворов испытуемого препарата и

стандартного образца.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТАХ

Белки - высокомолекулярные природные органические вещества,

построенные из L-аминокислот.

Для количественного определения белка используют

колориметрические и спектрофотометрические методы, в некоторых

случаях пользуются определением белка по содержанию общего азота в

препарате.

1. Колориметрические методы определения белка

При определении белка в лекарственных препаратах при помощи

колориметрических методов предварительно строят калибровочный

график с использованием стандартного образца белка, указанного в

частных статьях (бычьего сывороточного альбумина, сывороточного

альбумина человека или аминокислоты тирозина).

При определении белка в испытуемых пробах соблюдают те же

условия проведения реакций и измерения поглощения растворов, что и

при построении калибровочного графика.

1. Определение белка с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в

фиолетовый цвет комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными

связями молекулы белка.

Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей

аммония из-за образования медно - аммиачных комплексов.

1 мл раствора препарата, содержащего 1-10 мг испытуемого

белка, помещают в пробирку, прибавляют 4 мл биуретового реактива,

перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при

длине волны в диапазоне от 540 до 650 нм в кювете с толщиной слоя

10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же

реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 1 до 10

мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность

растворов при выбранной длине волны.

2. Микроопределение белка с реактивом Бенедикта

Принцип метода тот же, что и при определении белка с

биуретовым реактивом.

2 мл раствора препарата, содержащего 0,1-2 мг испытуемого

белка, помещают в пробирку, прибавляют 2 мл 6% раствора натра

едкого, 0,2 мл реактива Бенедикта, перемешивают и оставляют на 15

мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на

спектрофотометре при длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя

10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же

реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,1 до

2 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность

раствора при 330 нм.

3. Определение белка по методу Лоури

Метод основан на образовании окрашенных продуктов

ароматических аминокислот и цистеина с реактивом Фолина в

сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

1 мл раствора препарата, содержащего 0,025-0,250 мг

испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 2 мл реактива 1

и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем прибавляют

0,5 мл реактива Фолина, перемешивают и через 30-40 мин измеряют

оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 750 нм в

кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения

используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,025

до 0,250 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую

плотность растворов при 750 нм.

4. Определение белка по методу Лоури

в модификации Сяткина

Метод Лоури в модификации Сяткина используют для определения

содержания белка в препаратах с повышенным содержанием липо- и

гликопротеидов.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,5-2,5 мг испытуемого

белка, помещают в пробирку, прибавляют 0,8 мл раствора натра

едкого (1 моль/л) и 0,1 мл 1% раствора натрия дезоксихолата, затем

прибавляют 4 мл реактива II, смесь перемешивают. После

просветления раствора прибавляют 0,5 мл реактива Фолина,

немедленно перемешивают и оставляют на 30 мин в темном месте при

комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на

спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя

10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же

реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,5 до

2,5 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность

растворов при 750 нм.

5. Определение белка по методу Бредфорд

Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет

комплекса красителя кумасси ярко - голубого G-250 с белком.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,10 мг

испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива

Бредфорд, перемешивают и оставляют при комнатной температуре в

течение одинакового времени в интервале от 2 до 60 мин. Оптическую

плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 595 нм в

кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения

используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до

0,10 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность

растворов при 595 нм.

6. Определение белка по методу Седмака

Принцип метода тот же, что и в методе Бредфорд. Метод применим

для определения суммарного количества белков и полипептидов с

молекулярной массой более 3000 дальтон.

1,5 мл раствора препарата, содержащего 0,010-0,150 мг

испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 1,5 мл раствора

кумасси ярко - голубого G-250, перемешивают и выдерживают при

комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от

5 мин до 3 ч. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре

при двух длинах волн: 620 и 465 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов

без препарата и кумасси ярко - голубого G-250.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,005

до 0,150 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую

плотность растворов при 620 и 465 нм и откладывая по оси ординат

отношение оптических плотностей (D620/D465), по оси абсцисс -

соответствующие значения концентрации растворов стандартного

образца белка.

7. Определение белка по методу Флореса

Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет

комплекса белка с красителем бромфеноловым синим.

Комплекс устойчив в течение 8 ч.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,08 мг

испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 0,9 мл раствора

бромфенолового синего, выдерживают при комнатной температуре в

течение одинакового времени в интервале от 10 мин до 8 ч.

Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны

610 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора

сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до

0,08 мг стандартного образца белка (почти прямолинейная

зависимость), измеряя оптическую плотность растворов при 610 нм.

II.Спектрофотометрический метод определения белка

Спектрофотометрический метод определения белка основан на

способности ароматических аминокислот (триптофан, тирозин и в

меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с

максимумом поглощения при 280 нм.

Условно принято считать, что при концентрации белка в

растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм

равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют растворитель

препарата.

Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05

до 2 мг/л.

Определению белка данным методом мешают присутствие

нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20%). В этом случае

оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух

длинах волн - 260 и 280 нм; содержание белка Х (мг/мл)

рассчитывают по формуле Калькара:

Х = 1,45 х D280 - 0,74 х D260.

III. Определение белка по содержанию общего азота

Определение белка по содержанию общего азота основано на том,

что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и

может быть принято равным 16%. В том случае, если лекарственный

препарат, кроме белка, содержит другие вещества, в состав которых

входит азот, белок предварительно осаждают трихлоруксусной или

хлорной кислотой. При нагревании органического соединения с

концентрированной серной кислотой происходит его минерализация,

азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить

количественно.

1. Микрометод Кьельдаля

Определение проводят в соответствии со статьей "Определение

азота в органических соединениях" (ГФ XI, вып. 1, с. 180) со

следующими дополнениями: навеску препарата, содержащую 10-20 мг

испытуемого белка, помещают в колбу "в", затем осторожно

прибавляют 0,25 г растертой смеси калия сульфата, меди сульфата и

натрия селената, взятых в соотношении 20:5:8,5, и 2 мл

концентрированной серной кислоты. Проводят минерализацию, нагревая

колбу на горелке или плитке, пока раствор не станет прозрачным.

После этого продолжают нагревание еще в течение 30 мин. В конце

минерализации, когда вся вода испарится, прибавляют 1-2 капли

пергидроля и продолжают нагревание в течение 10 мин до

обесцвечивания раствора. Отгон титруют раствором

хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л).

Параллельно проводят контрольный опыт.

Разность между количеством миллилитров раствора

хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) в испытуемом и

контрольном опытах, умноженная на 0,14 г, соответствует количеству

миллиграммов азота во взятой навеске. Принимая содержание азота в

белке равным 16%, по количеству найденного азота рассчитывают

количество белка в опытной пробе.

2. Определение белка с реактивом Несслера

Навеску препарата, содержащую около 10 мг белка, минерализуют

по способу, описанному в микрометоде Кьельдаля. После

минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу

вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5-1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу

вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера

и доводят объем раствора водой до метки. Через 15 мин измеряют

оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 410 нм в

кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения

используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 30 до

60 мкг азота с использованием в качестве стандартного образца

аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над

серной кислотой.

Принимая содержание азота в белке равным 16%, по количеству

найденного азота рассчитывают количество белка в опытной пробе.

Примечания. Приготовление биуретового реактива: 0,75 г меди

сульфата и 3 г натрия - калия тартрата растворяют в 250 мл воды в

мерной колбе вместимостью 1 л, затем при энергичном перемешивании

прибавляют 150 мл 10% раствора натра едкого, свободного от

углекислоты, 1 г калия йодида, перемешивают и доводят объем

раствора водой до метки.

Раствор хранят в емкости из полиэтилена.

Приготовление реактива Бенедикта. 17,3 г натрия цитрата и 10 г

натрия карбоната безводного растворяют при нагревании в 50 мл воды

(не доводя до кипения), прибавляют 10 мл 17,3% раствора меди

сульфата, перемешивают, количественно переносят в мерную колбу

вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление 17,3% раствора меди сульфата: 17,3 г меди

сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и

доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление реактива I: состоит из двух растворов.

1. 4 г натра едкого растворяют в воде в мерной колбе

вместимостью 1 л, прибавляют 20 г натрия карбоната и доводят объем

раствора водой до метки.

2. 1 г меди сульфата растворяют в воде в мерной колбе

вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки; 2 г

натрия тартрата (ГОСТ 5845-79, ч. д. а.) или натрия цитрата

растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят

объем раствора водой до метки. Оба раствора сливают при

перемешивании.

Реактивом I служит смесь 49 мл раствора 1 и 1 мл раствора

2. Готовят перед употреблением.

Приготовление реактива II. 1 мл раствора 2 помещают в мерную

колбу вместимостью 50 мл и доводят 2% раствором натрия карбоната

до метки.

Приготовление 2% раствора натрия карбоната: 2 г натрия

карбоната помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют

в воде и доводят объем раствора до метки водой.

Приготовление 1% раствора натрия дезоксихолата:

1 г натрия дезоксихолата (ТУ 6-09-10-1292-78) растворяют в

воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора

водой до метки.

Приготовление реактива Бредфорд: 0,05 г кумасси ярко -

голубого G-250 растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 25

мл 95% спирта, прибавляют 50 мл 85% раствора кислоты ортофосфорной

и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор хранят в сосуде из оранжевого стекла не более 10 сут.

Приготовление раствора кумасси ярко - голубого G-250: 0,06 г

кумасси ярко - голубого G-250 растворяют в мерной колбе

вместимостью 100 мл в растворе хлористоводородной кислоты (0,6

моль/л) и доводят объем раствора той же кислотой до метки,

фильтруют. Оптическая плотность полученного раствора при длине

волны 465 нм должна быть не менее 1,3 и не более 1,5.

Приготовление раствора бромфенолового синего:

0,0075 г бромфенолового синего водорастворимого (ТУ

6-09-3719-83) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 15

мл 95% спирта, прибавляют 2,5 мл ледяной уксусной кислоты,

перемешивают и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление натрий - цитратного буферного раствора рН 5,0: в

колбу вместимостью 1 л помещают 400 мл воды, 5 мл кислоты

хлористоводородной концентрированной, 41,7 г натрия цитрата,

перемешивают при нагревании до полного растворения, затем

прибавляют 1 г фенола, перемешивают, количественно переносят в

мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до

метки.

Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. С в течение 15

сут.

Приготовление нингидринового реактива: в сосуд из оранжевого

стекла вместимостью 1 л помещают 375 мл монометилового эфира

этиленгликоля (ТУ 6-09-08-4398-77), прибавляют 125 мл

натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5, при перемешивании

на магнитной мешалке пропускают азот в течение 10 мин, затем

прибавляют 10 г нингидрина и вновь пропускают азот в течение 10

мин, продолжая перемешивание на магнитной мешалке до полного

растворения нингидрина. После этого прибавляют 0,19 г олова

двухлористого 2-водного и перемешивают.

Хранят реактив в сосуде из оранжевого стекла при температуре

от 4 до 10 град. С не более 15 сут.

Приготовление натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5:

82 г натрия ацетата плавленого (ТУ 6-09-246-70) растворяют при

перемешивании в мерной колбе вместимостью 250 мл в 140 мл воды,

прибавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора

водой до метки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИНКА В ПРЕПАРАТАХ ИНСУЛИНА

Спектрофотометрический метод. В две мерные колбы вместимостью

50 мл помещают: в одну - 5 мл препарата или раствора инсулина, или

1,5 мл надосадочной жидкости (для суспензии инсулина), в другую -

5 мл разбавленного раствора стандартного образца цинка. В каждую

колбу прибавляют по 10 мл буферного раствора (рН 9,0), 3 мл

раствора цинкона и доводят объем растворов водой до метки.

Растворы перемешивают и через 1 ч измеряют оптическую плотность на

спектрофотометре при длине волны 620 нм в кювете с толщиной слоя

10 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным с теми

же реактивами.

Содержание цинка (X) в препарате или надосадочной жидкости в

миллиграммах на 100 ЕД инсулина вычисляют по формуле:

D1 х 0,001 х 50 х 2,5

Х = ----------------------

D0 х V

где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора препарата или

надосадочной жидкости; D0 - оптическая плотность разбавленного

раствора стандартного образца цинка; 0,001 - содержание цинка в

миллиграммах в 1 мл измеряемого разбавленного раствора

стандартного образца цинка; 2,5 - количество препарата в

миллилитрах, содержащего 100 ЕД инсулина (при содержании инсулина

40 ЕД в 1 мл препарата); V - объем препарата, раствора инсулина

или надосадочной жидкости в миллилитрах, взятых для анализа.

Примечания. 1. Приготовление раствора инсулина: навеску

инсулина, содержащую 400 ЕД, растворяют в растворе

хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) в мерной колбе

вместимостью 10 мл и доводят объем раствора этим же раствором

хлористоводородной кислоты до метки.

2. Приготовление надосадочной жидкости суспензии: содержание

флакона (5 мл) тщательно перемешивают, вносят в центрифужную

пробирку и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 4000-6000

об/мин.

3. Приготовление раствора стандартного образца цинка: 0,4400 г

цинка сульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 1 л в

небольшом количестве свежепрокипяченной и охлажденной воды и

доводят объем раствора этой же водой до метки. Раствор

стандартного образца цинка содержит 0,1 мг цинка в 1 мл.

Срок годности раствора 14 сут, хранение при температуре 4 - 8

град. С.

4. Приготовление разбавленного раствора стандартного образца

цинка: 10 мл раствора стандартного образца цинка помещают в колбу

вместимостью 100 мл и доводят объем раствора свежепрокипяченной и

охлажденной водой до метки. Разбавленный раствор стандартного

образца цинка содержит 0,01 мг цинка в 1 мл.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

5. Приготовление раствора борной кислоты (0,2 моль/л) с калия

хлоридом. 12,3670 г перекристаллизованной борной кислоты и 14,9110

г калия хлорида растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной воде

в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора этой же

водой до метки.

Срок годности раствора 30 сут, хранение при температуре 4 - 8

град. С.

6. Приготовление буферного раствора рН 9,0

(потенциометрически): 50 мл раствора борной кислоты (0,2 моль/л) с

калия хлоридом помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл,

прибавляют 21,3 мл раствора натра едкого (0,2 моль/л) и доводят

объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

7. Приготовление раствора цинкона: 0,13 г цинкона

(ТУ-6-0907-315-85 или фирмы "Хемапол", ЧССР) растирают в ступке с

2 мл раствора натра едкого (1 моль/л), количественно переносят в

мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора

свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки и фильтруют.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

Определение цинка в препаратах инсулина с протамином. 5 мл

тщательно перемешанного препарата помещают в мерную колбу

вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и

перемешивают; 5 мл полученного раствора и 5 мл разбавленного

раствора стандартного образца цинка помещают в две другие мерные

колбы вместимостью по 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 1 мл

раствора хлористоводородной кислоты (0,1 моль/л), 10 мл буферного

раствора (рН 9,0), 1 мл раствора натра едкого (0,1 моль/л) и 2 мл