1. Начальная скорость реакции (v0). Типичная кинетическая

кривая ферментативной реакции приведена на рис. 1. <*> Для каждой

ферментативной реакции могут быть подобраны условия, при которых

начальный участок кривой линеен, т.е. зависимость концентрации

образовавшегося продукта или израсходованного субстрата от времени

наблюдения (t) имеет прямо пропорциональный характер.

--------------------------------

<*> Рис. 1. Типичная кинетическая кривая.

На оси абсцисс - время наблюдения, на оси ординат -

концентрация образовавшегося продукта. (Рисунок не приводится).

Под начальной скоростью реакции в этих условиях понимают

скорость, соответствующую линейному участку, и определяют ее как

тангенс угла наклона этого участка.

Поскольку длительность прямолинейного участка кинетической

кривой от опыта к опыту несколько изменяется, время инкубации

должно составлять не более 70% и не менее 20% времени

соответствующего прямолинейного участка.

2. Концентрация субстрата ([s]). Скорость реакции зависит от

концентрации субстрата вплоть до его насыщающей концентрации. Под

насыщающей концентрацией понимают такую концентрацию субстрата,

при которой скорость реакции перестает повышаться при дальнейшем

увеличении концентрации субстрата (Рис. 2, а). <*> При проведении

ферментативной реакции реакционная смесь должна содержать такое

количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в

течение всего хода определения (количество субстрата, взятого для

проведения ферментативной реакции, должно быть примерно на 30%

выше значения точки насыщения).

После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо

проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [Р] от t.

В случае фермента, для которого характерно ингибирование

субстратом (Рис. 2, б), <*> оптимальной концентрацией субстрата

является та концентрация, при которой скорость реакции максимальна

(точка перегиба на экспериментальной кривой зависимости скорости

реакции от концентрации субстрата).

--------------------------------

<*> Рис. 2. Зависимость скорости реакции v от концентрации

субстрата (S).

а - концентрация субстрата; б - фермент, для которого

характерно ингибирование субстратом. (Рисунок не приводится).

3. Концентрация фермента ([е]). Выбор необходимой концентрации

фермента осуществляется экспериментально при помощи построения

кривой зависимости скорости реакции от концентрации фермента.

Используется участок прямолинейности так, чтобы выбранная точка

отстояла не менее чем на 30% как от нижней, так и от верхней

концентрации фермента, ограничивающих прямолинейный участок кривой

(рис. 3). <*>

--------------------------------

<*> Рис. 3. Зависимость скорости реакции v от концентрации

фермента (Е).

Используется участок прямолинейности так, чтобы выбранная

точка отстояла не менее чем на 30% как от нижней (а), так и от

верхней (б) концентрации фермента, ограничивающих прямолинейный

участок кривой. (Рисунок не приводится).

После выбора концентрации фермента необходимо проверить,

сохраняется ли при ней линейная зависимость [Р] от t при выбранном

значении насыщающей концентрации субстрата.

4. Температура. Ферментативную реакцию рекомендуется проводить

в термостате при температуре (37 +/-0,1) град. С. Предварительно

каждый из реагентов необходимо прогреванием довести до 37 град. С.

5. рН. Типичная кривая, описывающая зависимость скорости

ферментативной реакции от рН, для большинства ферментов приведена

на рис. 4 <*>. Активность следует определять при оптимальном

значении рН. Оптимальное значение рН должно быть определено при

выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей

концентрации субстрата, температуре (37 +/-0,1) град. С и

использовании буферного раствора того состава, который не

ингибирует фермент.

--------------------------------

<*> Рис. 4. Зависимость скорости реакции v от значения рН.

(Рисунок не приводится).

После выбора оптимального значения рН необходимо проверить,

сохраняется ли при этом рН линейная зависимость [Р] от t при

выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей

концентрации субстрата.