37 Град. С от 16 до 18 ч. После этого измеряют диаметры зон

стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой концентраций

растворов Государственного стандартного образца.

После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают

среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9

зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной

концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.

По разности между средней величиной зоны контрольной

концентрации раствора (0,05 мкг/мл), выведенной из всех чашек, и

средней величиной зоны контрольной концентрации раствора

Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с

каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны

данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней

величине зоны данной концентрации, если она положительная, и

вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают

поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.

Содержание C63H88CoN14O14P (цианокобаламина) в одном драже или

одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

С х б х К

Х = -------------,

а х 1 000 000

где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора,

найденное по стандартной кривой, в микрограммах; К - коэффициент

разведения; а - навеска препарата в граммах или количество

таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в

граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы.

Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного

стандартного образца цианокобаламина: 0,0250 г Государственного

стандартного образца цианокобаламина в пересчете на 100% вещество

растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и

доводят объем раствора тем же спиртом до метки.

1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина

(основной раствор).

Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6

град. С в банке оранжевого стекла с притертой пробкой. 1 мл

основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и

доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор

годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 12 до 15

град. С.

1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из

рабочего раствора Государственного стандартного образца в день

определения готовят растворы, содержащие 0,025; 0,05 и 0,075 мкг

цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл

рабочего раствора Государственного стандартного образца помещают в

мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в

колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.

Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают

за раствор Государственного стандартного образца контрольной

концентрации.

2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям

величин зон приготовленных концентраций и средней величине зоны

контрольной концентрации из всех чашек строят стандартную кривую,

откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а

на оси ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста.

По полученным точкам вычерчивают кривую.

Применяемые для построения кривой концентрации не должны

отличаться от контрольной концентрации более чем на -40 или +50%.

3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную

культуру выращивают на скошенной агаровой среде и хранят в

холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на свежую

среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С.

Состав среды для хранения культуры:

казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл

калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г

железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г

магния сульфата (х. ч.) 0,02 г

L-аспарагина (ч.) 0,02 г

глицерина (ч.) 0,2 г

агара микробиологического 1,5 г

цианокобаламина 10 мкг

воды до 100 мл

рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).

Ингредиенты растворяют последовательно в воде.

Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2

капель раствора хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом

подогревании и прибавляют к раствору солей; устанавливают рН

полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем

среды водой до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара

микробиологического. Смесь подогревают на водяной бане до полного

растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За

сутки до проведения анализа тест - культуру пересевают на

скошенный пептонно - солевой агар следующего состава:

пептона ферментативного сухого 2 г

натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г

агара микробиологического 1,8 г

воды до 100 мл

рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).

Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным

паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20

мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении. На скошенный агар

делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16

до 18 ч при 37 град. С и используют для приготовления посевного

материала.

4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г

казеина размолотого смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл

20% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь нагревают с

обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения

казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на

электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при

пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому

остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до

получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды,

растворяют оставшуюся массу приблизительно в 100 мл воды,

устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и

объем раствора доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г

угля активированного осветляющего, встряхивают в течение 1 ч,

затем фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем

повторяют еще раз и получают бесцветный или светло - желтый

раствор, который разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют

насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати

(0,1 МПа) 20 мин.

5. Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты: 425

мл концентрированной хлористоводородной кислоты (d 1,19)

разбавляют водой до 1 л.

6. Приготовление посевного материала: делают смыв суточной

тест - культуры со скошенного пептонно - солевого агара раствором

натрия хлорида изотоническим 0,9%. Плотность микробной взвеси

должна быть от 1 до 2 млрд микробных клеток в 1 мл.

7. Приготовление основной питательной среды.

Состав среды:

аммония хлорида (х. ч.) 2 г

натрия хлорида (х. ч.) 3 г

калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,4 г

натрия цитрата трехзамещенного (х. ч.) 3 г

сахара молочного 3 г

агара микробиологического 15 г

воды дистиллированной до 1 л

рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).

Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным

водяным паром в автоклаве при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Хранят в

прохладном месте не более 2 мес. Перед розливом в чашки Петри в

расплавленную среду прибавляют по 5 мл стерильного 40% раствора

глюкозы на каждые 200 мл среды.

Раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 ати (0,05 МПа) в течение

15 мин.

7. Приготовление 1% раствора натрия цитрата: 10 г натрия

цитрата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и

доводят объем раствора водой до метки.

Раствор годен в течение 7 сут при хранении при температуре от

5 до 10 град. С.

7. Определение содержания

кислоты никотиновой (витамина РР)

Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или

количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок,

указанных в соответствующих частных статьях, взбалтывают в горячей

воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, охлаждают и доводят объем

раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл

отбрасывают. Из полученного фильтрата готовят раствор второго

разведения с таким расчетом, чтобы содержание кислоты никотиновой

в нем составляло около 0,005 мг в 1 мл.

В две конические колбы с притертой пробкой вместимостью 50 мл

помещают по 5 мл испытуемого раствора, в третью колбу - 5 мл

раствора рабочего стандартного образца кислоты никотиновой, в

четвертую - 5 мл воды (контрольный опыт на реактивы).

Колбы помещают на 5 мин на водяную баню при температуре 50

град. С. Затем из бюретки (под тягой) во все колбы прибавляют по 2

мл роданобромидного раствора, перемешивают и оставляют на 10 мин

на водяной бане при той же температуре. Затем колбы быстро

охлаждают до комнатной температуры и выдерживают в защищенном от

света месте в течение 1 ч. Одновременно проводят контрольный опыт

на посторонние окрашенные вещества, присутствующие в растворе. Для

этого к 5 мл испытуемого раствора прибавляют 3 мл раствора метола

и 2 мл воды.

Измеряют оптическую плотность растворов желтого цвета на

фотоэлектроколориметре при длине волны около 440 нм в кюветах с

толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание C6H5NO2 (кислоты никотиновой) в одном драже или

одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

(D - D1) х 0,005 х 100 х V3 х б

Х = -------------------------------- =

(D0 - D2) х а х V2 х 1000

(D - D1) х V3 х б

= --------------------------,

(D0 - D2) х a х V2 х 2000

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D1 - оптическая

плотность контрольного опыта на посторонние окрашенные вещества;

D0 - оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца

кислоты никотиновой; D2 - оптическая плотность контрольного опыта

на реактивы; 0,005 - содержание кислоты никотиновой в 1 мл

раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; 100, V2 и

V3 - разведения в миллилитрах; а - навеска препарата в граммах или

количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного

драже или одной таблетки, г; 1000 - пересчет в граммы.

Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного

образца кислоты никотиновой: 0,5000 г кислоты никотиновой

растворяют в горячей воде в мерной колбе вместимостью 500 мл,

прибавляют 5 мл раствора серной кислоты (5 моль/л) и доводят объем

раствора водой до метки (основной раствор).

Раствор годен в течение 6 мес при хранении в банке оранжевого

стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С.

0,5 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью

100 мл и доводят объем раствора водой до метки.

1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,005 мг

кислоты никотиновой. Раствор используют свежеприготовленный.

2. Приготовление раствора серной кислоты (5 моль/л): медленно

и осторожно, при постоянном перемешивании, вливают 30 мл

концентрированной серной кислоты в 102 мл воды.

3. Очистка метола: 100 г метола (ч. д. а. или ч.) смешивают с

0,7 г натрия бисульфита и вносят в кипящие 500 мл раствора серной

кислоты (0,05 моль/л). Если раствор сильно окрашен, к нему

прибавляют 10 г активированного угля.

Кипящий раствор быстро фильтруют через воронку Бюхнера,

которая предварительно нагрета горячей водой. Фильтрат переносят в

химический стакан вместимостью 1 л, прибавляют 0,3 г натрия

бисульфита, 0,7 л 95% спирта, перемешивают, помещают в холодильник

и оставляют на 18 ч. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на воронке

Бюхнера, промывают 3 раза 95% спиртом и высушивают на воздухе в

темноте. Перекристаллизованный метол хранят в банке оранжевого

стекла с притертой пробкой в защищенном от света месте.

При изменении метола его следует повторно

перекристаллизовывать.

4. Приготовление раствора метола: перед употреблением готовят

8% раствор метола в растворе хлористоводородной кислоты (0,5

моль/л).

5. Приготовление роданобромидного раствора (проводят под

тягой): к 4 мл брома прибавляют 100 мл воды, энергично встряхивают

и отстоявшийся раствор декантируют.

К охлажденной на льду бромной воде (взятой в количестве,

нужном для анализа) прибавляют по каплям 10% раствор аммония

роданида или калия до светло - желтого окрашивания, затем

прибавляют 1% раствор аммония роданида до полного обесцвечивания и

небольшими порциями кальций углекислый до прекращения выделения

углекислого газа и образования осадка. Раствор фильтруют в банку

оранжевого стекла с притертой пробкой и хранят при температуре от

5 до 10 град. С.

Раствор годен в день приготовления.

8. Определение содержания никотинамида

Определение проводят одним из приведенных ниже методов.

1. Точную навеску порошка растертых драже или таблеток, или

соответствующее количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых

в порошок, содержащих около 0,05 г никотинамида, количественно

переносят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем

раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл

отбрасывают, 10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу

вместимостью 50 мл, прибавляют 25 мл раствора едкого кали (0,2

моль/л), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Полученный раствор помещают в электролитическую ячейку

полярографа, пропускают ток азота в течение 5 мин и

полярографируют, начиная с - 1,4 В.

Параллельно снимают полярограмму раствора рабочего

стандартного образца никотинамида.

Содержание C6H6N2O (никотинамида) в одном драже или одной

таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

H1 х 0,1 х 100 х 50 х б H1 х б

Х = ------------------------- = -------------,

Н0 х а х 10 х 1000 Н0 х а х 20

где Н1 - высота полярографической волны испытуемого раствора; Н0 -

высота полярографической волны раствора рабочего стандартного

образца никотинамида; 0,1 - содержание никотинамида в 1 мл

раствора рабочего стандартного образца никотинамида в

миллиграммах; 100, 50 и 10 - разведения в миллилитрах; а - навеска

препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б

- средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 -

пересчет в граммы.