Экспрессия генов Патрушев

191

трансляции EF-Tu, молекулы GTP и очередной аминоацилированной тРНК с A- участком рибосомы (см. рис. I.20, стадия Е1). Вхождение аминоацилированной тРНК в A-участок происходит в соответствии с установленным в нем кодоном транслируемой мРНК. При этом лишь та аминоацилированная тРНК прочно связывается с рибосомой, у которой антикодон комплементарен кодону, установленному в A-участке. После гидролиза GTP и освобождения EF-Tu•GDP из комплекса (стадия Е2) происходит образование новой пептидной связи между карбоксильной группой формилметионина инициаторной тРНК и NH2- группой аминокислотного остатка, находящегося в A-участке рибосомы в составе аминоацил-тРНК (стадия Е3). Эта стадия получила название транспептидации. Обмен GDP на GTP в освободившемся комплексе EFTu•GDP происходит с участием фактора EF-Ts.

Образовавшийся в итоге пептид удерживается рибосомой через остаток тРНК, находящийся в A-участке, а освободившаяся тРНК временно сохраняется в так называемом E-участке рибосомы (от англ. exit – выход). Такая соединенная с пептидом тРНК получила название пептидил-тРНК. Образовавшаяся пептидил-тРНК далее переносится из A- в P-участок рибосомы. Эта стадия элонгации (Е4) известна под названием транслокации. Транслокация индуцируется фактором элонгации EF-G, который освобождается из элонгирующего комплекса после расщепления молекулы GTP. Таким образом, энергия еще одной молекулы GTP используется в акте транслокации. После завершения транслокации происходит освобождение фактора EF-G из элонгирующего комплекса. При этом A-участок рибосомы остается свободным. Следующий цикл элонгации начинается с вхождения в A-участок рибосомы в составе тройного комплекса очередной молекулы тРНК (стадия Е1), что сопровождается освобождением формилметионил-тРНКfMet из E-участка, после чего повторяются все остальные вышеперечисленные стадии элонгации. В физиологических условиях рибосома совершает 20 циклов элонгации в секунду. В соответствии с этим для синтеза белка длиной в 200 аминокислотных остатков требуется 10 секунд.

В рассмотренной классической модели биосинтеза белка с тремя участками связывания тРНК на любой стадии элонгации с рибосомой взаимодействуют две молекулы тРНК. Иными словами, до стадии транслокации тРНК занимают A- и P-участки рибосомы, тогда как после транслокации

192

молекулы ассоциированы с P- и E-участками. Между участками A и E существует аллостерическое взаимодействие, что проявляется в отрицательном кооперативном эффекте связывания молекул тРНК этими участками и означает, что только A- или E-участки рибосомы могут быть заняты молекулой тРНК, и рибосома не содержит одновременно занятыми оба участка.

Молекулярная мимикрия фактора элонгации EF-G. Недавно было обнаружено, что пространственная структура домена IV полипептидной цепи фактора элонгации EF-G имитирует структуру тРНК в ее комплексе с другим фактором элонгации EF-Tu. При этом структура соответствующей части полипептидной цепи EF-G напоминает форму антикодоновой петли тРНК в комплексе с фактором элонгации, ее положение относительно кóровой части EF-Tu и даже распределение электростатических зарядов на поверхности полипептида, которое соответствовало таковому углевод-фосфатного остова тРНК. Это открытие позволило по-новому посмотреть на механизм действия EF-G в цикле трансляции. Такого рода данные позволили предположить, что домен IV фактора EF-G занимает во время некоторых этапов транслокации ту же часть A-участка рибосом, что и тРНК. Однако остается непонятным, каким образом это может физически влиять на прохождение акта транслокации.

Терминация трансляции. Процесс трансляции вступает в завершающую фазу после того, как в A-участок рибосомы попадает терминирующий (бессмысленный) кодон мРНК, а пептидил-тРНК перемещается в донорный P-участок рибосомы. Белковые факторы RF1 и RF2 участвуют в распознавании последовательностей нуклеотидов терминирующего кодона. Фактор RF3, также как и EF-G, имитирует структурные особенности фактора EFTu, что дает ему возможность взаимодействовать с А-участком рибосомы. Но поскольку с ним не связана аминоацилированная тРНК, его присутствие в А- участке приводит к обрыву строящейся цепи полипептида. После формирования такого комплекса происходит расщепление сложноэфирной связи между полипептидом и тРНК, а также освобождение синтезированного полипептида. С помощью мутационного анализа было установлено, что молекулы рРНК обеих субчастиц рибосом E. coli участвуют в гидролизе пептидил-тРНК.

Для того чтобы рибосома оставшегося комплекса рибосома–мРНК–тРНК могла вступить в следующий цикл трансляции, она должна освободиться из

193

него. Установлено, что вышеупомянутые рибосомные рилизинг-факторы (RF) совместно с фактором EF-G при участии молекулы GTP обеспечивают диссоциацию комплекса на составные компоненты, которые затем вступают в новый раунд белкового синтеза. Фактор RF4 (иначе называемый RRF – ribosome-recycling factor) не имеет аналога у эукариот. Его роль, по-видимому, заключается в стимуляции перемещения молекулы деацилированной тРНК из P-участка в E-участок рибосомы и(или) удалении оставшегося RF-фактора из A- участка. Это способствует полному освобождению рибосомы и ее вовлечению в новый цикл трансляции в результате инициации или реинициации синтеза белка. Отделившаяся от мРНК рибосома перед вступлением в новый цикл диссоциирует на две субчастицы под действием фактора инициации трансляции IF3. Альтернативно, в том случае, если новый инициирующий кодон полицистронной матрицы находится достаточно близко от стоп-кодона, синтез белка может быть реинициирован.

Реинициация трансляции. Реинициацией трансляции называют повторное вступление рибосом, терминировавших биосинтез белка, в цикл трансляции без предварительного отделения их от мРНК. Реинициация синтеза белка широко распространена у E. coli и играет важную роль в контроле экспрессии генов этого микроорганизма на уровне трансляции. Это связано с тем, что значительная часть бактериальных мРНК полицистронна, а, следовательно, за терминирующим кодоном одного цистрона на небольшом от него удалении располагается инициирующий кодон следующего. Благодаря реинициации имеет место координированная (сопряженная) трансляция нескольких ОРС, объединенных в полицистронной матрице.

Имеются данные о том, что рибосомы E. coli, терминировавшие синтез полипептида, обладают способностью перемещаться на короткие расстояния в окрестностях терминирующего кодона и после встречи с инициирующим кодоном в новом сайте инициации трансляции могут начать следующий раунд трансляции без отделения от мРНК. Новый инициирующий кодон может располагаться выше или ниже стоп-кодона предыдущего гена, а может и перекрываться с ним (например, в последовательности AUGA). Реинициация может происходить с полной эффективностью, если в сайте реинициации имеется адекватная SD-последовательность, а терминирующий и инициирующий кодоны расположены достаточно близко друг к другу (менее

194

эквивалента длины рибосомы). Последнее обстоятельство указывает на быструю кинетику отделения терминировавших рибосом от мРНК.

Важным следствием сопряжения трансляции у прокариот через реинициацию является зависимость экспрессии целой серии генов, принадлежащих одному оперону, от трансляции первой ОРС полицистронной матрицы. При этом следует заметить, что сопряжение экспрессии генов на уровне трансляции может оказывать и негативное влияние на эффективность трансляции нижерасположенных цистронов.

Если обычная инициация трансляции у E. coli на кодоне UUG происходит с очень низкой эффективностью, то реинициирующие рибосомы используют его для начала синтеза белка весьма охотно. Это объясняют отсутствием фактора IF3 в реинициирующем комплексе, который во многом определяет точность выбора инициирующего кодона рибосомами.

На поведение рибосом, терминировавших синтез белка, большое влияние оказывают и факторы терминации трансляции (RF). В опытах с мутантным бактериофагом R17, содержащим амбер-кодон в положении 7 гена белка оболочки, было установлено, что в отсутствие фактора терминации трансляции RF4 вслед за терминацией трансляции на бессмысленном кодоне имела место реинициация трансляции на следующем кодоне мРНК, что завершалось синтезом белка оболочки, укороченного с N-конца на 7 аминокислот. На этом основании полагают, что рилизинг-фактор RF4 в обычных условиях предотвращает распознавание аминоацилированной тРНК кодона, находящегося в А-участке рибосомы, который в мРНК следует за терминирующим.

Альтернативные модели цикла трансляции. В рассмотренной выше классической модели трансляции перемещение молекул тРНК на большой и малой субчастицах рибосом сопряжено друг с другом. В отличие от этого, в

активно обсуждающейся модели гибридных состояний (hybrid states model)

перемещение тРНК между A- и P-участками 30S субчастицы происходит независимо от перемещения тРНК между A-, P- и E-участками большой субчастицы. В соответствии с этой моделью аминоацил-тРНК попадает в пептидил-тРНК–рибосомный комплекс в составе тройного комплекса EFTu•GTP•тРНК и взаимодействует с ней первоначально в гибридном состоянии A/E. В этом состоянии антикодоновая часть тРНК связывается с A-участком

195

30S субчастицы, а ее CCA-конец, удерживаемый EF-Tu, располагается в E- участке большой субчастицы и, возможно, частично на малой субчастице. Вслед за гидролизом GTP происходит освобождение EF-Tu, что делает возможным перемещение CCA-конца аминоацил-тРНК в A-участок большой субчастицы, приводящее к возникновению A/A-состояния, эквивалентного состоянию взаимодействия аминоацил-тРНК с A-участком в классической модели. После образования пептидной связи аминоацил-тРНК, уже связанная с растущей полипептидной цепью, перемещается в P-участок большой субчастицы, а деацилированная тРНК переходит в E-участок большой субчастицы. Вновь образованная пептидил-тРНК находится теперь в гибридном A/P-состоянии: антикодоновая часть остается в A-участке 30S субчастицы, а CCA-конец занимает P-участок большой субчастицы рибосом. При этом деацилированная тРНК находится в гибридном P/E-состоянии: антикодоновый конец остается в P-участке малой субчастицы, тогда как CCA-конец занимает E- участок большой субчастицы. Далее фактор элонгации EF-G в GTP-зависимой реакции обеспечивает перемещение антикодоновой части тРНК, находящейся

вгибридном состоянии, вместе с мРНК относительно 30S субчастицы. При этом пептидил-тРНК переходит в чувствительное к пуромицину P/P-состояние, соответствующее ее взаимодействию с P-участком в классической модели, а деацилированная тРНК находится в E-состоянии и на этом этапе трансляции может взаимодействовать только с E-участком большой субчастицы рибосом.

По крайней мере, три интересных следствия вытекают из модели гибридного состояния. Во-первых, пептидильная часть растущего пептида остается на рибосомах в стационарном состоянии, а во время трансляции перемещается тРНК. Во-вторых, транслокация тРНК происходит в два этапа: во время первой стадии обе молекулы тРНК движутся относительно большой субчастицы, на втором этапе обе молекулы тРНК вместе со связанной с ними мРНК перемещаются относительно малой 30S субчастицы рибосом. В-третьих,

впроцессе синтеза белка имеют место не два или три состояния связывания тРНК, а шесть или даже, возможно, семь таких состояний.

Спомощью физических методов были получены прямые доказательства спонтанного прохождения стадии транслокации, опосредуемой пептидилтрансферазой рибосом. При использовании флуоресцентных зондов, связанных с различными участками тРНК и рибосом, удалось обнаружить

196

изменения в квантовом выходе флуоресценции и анизотропные эффекты при образовании пептидной связи, что указывало на перемещение молекулы тРНК относительно рибосомных белков S21 и L11. На основании этих данных было высказано предположение, что во время пептидилтрансферазной реакции пептидильная цепь остается в постоянном положении относительно рибосомы, а перемещаются молекулы тРНК. Эта модель пептидилтрансферазной реакции получила название модели перемещения (displacement model). Она обладает многими общими чертами с моделью гибридного состояния, однако отличается тем, что в этой модели движение мРНК в пептидилтрансферазной реакции сопровождает перемещение тРНК.

Замечания о точности трансляции. Сама по себе стабильность кодон– антикодоновых взаимодействий не может обеспечивать наблюдаемую высокую точность трансляции. Рибосомы активно участвуют в акте распознавания молекулами тРНК соответствующих кодонов мРНК, повышая точность функционирования этого механизма, по крайней мере, на четыре порядка. Данный эффект объясняют функционированием механизмов, корректирующих ошибки на этом этапе трансляции, которые сопряжены с EF-Tu-зависимым гидролизом GTP во время выбора соответствующей аминоацилированной тРНК. Недавние измерения скорости гидролиза GTP рибосомами в присутствии правильной (cognate) или неправильной (noncognate) тРНК и искусственной матрицы показали, что в первом случае она выше в 104 раз. Это приводит к преимущественному освобождению комплекса EF-Tu•GDP из рибосом, содержащих правильные аминоацил-тРНК в А-участке. Для реализации данного механизма рибосомы должны распознавать правильные и ошибочные кодон-антикодоновые взаимодействия, а также передавать эту информацию своему GTPазному центру.

Мутантные рибосомы, для которых характерна пониженная точность трансляции, как правило, обладают более высоким сродством к тРНК в A- участке. Напротив, у "сверхточных" рибосом такое сродство понижено. В соответствии с этим повышенную точность трансляции можно объяснять в терминах уменьшения неспецифического связывания аминоацилированных тРНК A-участком рибосом и vice versa. Недавно было показано, что сродство тРНК к P-участку таких мутантных рибосом изменяется на противоположное таковому A-участка: у ram-мутантов с низкой точностью трансляции

197

наблюдается пониженное сродство P-участка к тРНК, а у "сверхточных" рибосом это сродство повышено. Таким образом, в настоящее время полагают, что простые реципрокные отношения связывают A- и P-участки рибосом с механизмами, которые управляют взаимодействием мРНК и соответствующих тРНК с рибосомами.

Новая 10Sa РНК, функционирующая в трансляции. В том случае, если транслируемая бактериальная мРНК укорочена в своей 3’-концевой части и рибосома не находит в соответствующей рамке считывания терминирующий кодон, она не может закончить трансляцию с помощью стандартного механизма терминации. Полагают, что, столкнувшись с такой ситуацией, рибосома останавливается на конце мРНК и с ней взаимодействует недавно открытая 10Sa РНК, кодируемая у E. coli геном ssrA, которая запускает процесс деградации частично синтезированного полипептида. Эта необычная РНК, аминоацилированная остатком Ala на своем 3’-конце, подобном стандартной акцепторной последовательности тРНК, сочетает в себе свойства тРНК и мРНК. 10Sa РНК, как и тРНКAla, образует внутреннюю пару оснований G3:U70, которая необходима для специфического распознавания тРНКAla рибосомами. После взаимодействия с рибосомой эта РНК вступает в стандартный цикл трансляции: ее остаток Ala включается в недостроенную цепь полипептида. Вслед за этим рибосома транслирует короткую последовательность нуклеотидов 10Sa РНК, которая теперь функционирует в качестве матрицы, добавляя десять аминокислот – ANDENYALAA – в C-конец укороченной полипептидной цепи, и терминирует трансляцию на UAA-кодоне 10Sa РНК. C- Концевая олигопептидная последовательность освободившегося полипептида далее распознается специфической протеиназой, которая расщепляет этот полипептид, обеспечивая его утилизацию бактериальной клеткой в процессе катаболизма.

2.4.3. Антибиотики, действующие на уровне трансляции

На рис. I.21 приведены некоторые широко распространенные антибиотики, являющиеся ингибиторами биосинтеза белка у бактерий. Многие из них находят применение не только как лекарственные средства, но и как превосходные инструменты исследования механизма различных этапов биосинтеза белка. Биохимический анализ мутантов бактерий, устойчивых к

198

действию конкретных антибиотиков, позволяет обнаруживать сайты действия антибиотиков на рибосомах и идентифицировать изменения компонентов системы белкового синтеза под влиянием этих мутаций. Как правило, для возникновения устойчивости к антибиотику достаточно замены одного аминокислотного остатка из 7500 остатков белков, составляющих бактериальную рибосому. То же самое относится и к 4500 основаниям рибосомных РНК. В этом случае не только замены одиночных оснований в рРНК, но и модификация (метилирование) единственного основания могут приводить к подобным эффектам. Рассмотрим механизм действия некоторых антибиотиков более подробно.

Рис. I.21. Антибиотики – ингибиторы биосинтеза белка у бактерий

199

Пуромицин. Этот антибиотик представляет собой производное нуклеозидов и является структурным аналогом 3’-концевой аминоацилированной группировки тРНК. Прямыми экспериментами было показано, что пуромицин конкурентным образом замещает очередную аминоацил-тРНК в A-сайте рибосом в процессе трансляции. Он участвует в акте образования пептидной связи в рибосоме, подменяя при этом очередную аминоацил-тРНК. В ходе реакции транспептидации происходит переброска C- конца растущего пептида от пептидил-тРНК на свободную аминогруппу его аминоацильного остатка, что приводит к освобождению пептидил-пуромицина из рибосом и прекращению биосинтеза белка. Пуромицин одинаково хорошо подавляет биосинтез белка как прокариотическими, так и эукариотическими рибосомами.

Хлорамфеникол. Участок лабильного связывания этого антибиотика локализован на 50S субчастице рибосом. Хлорамфеникол полностью ингибирует реакцию пуромицина с пептидил-тРНК, выступая его конкурентным ингибитором. При этом синтез пептида полностью прекращается, и он остается связанным с рибосомами. Предполагают, что хлорамфеникол имитирует аминоацильный конец молекулы аминоацил-тРНК, а его дихлорацетамидная группировка соответствует аминоацилу. Местом действия хлорамфеникола является A-участок 50S субчастицы рибосом, где антибиотик конкурирует с аминоацильным концом молекулы аминоацил-тРНК, препятствуя ее вхождению в A-участок, что сопровождается подавлением биосинтеза белка. В отличие от пуромицина хлорамфеникол ингибирует только бактериальные рибосомы. Сходным механизмом действия обладают антибиотики линкомицин и спарсомицин. Последний делает ассоциацию пептидил-тРНК с P-участком рибосом более прочной. При этом хлорамфеникол и линкомицин способны вытеснять спарсомицин из его комплекса с рибосомами.

Фусидовая кислота – антибиотик стероидной природы, блокирует биосинтез белка на стадии транслокации. Его мишенью является не столько сама рибосома, сколько белковый фактор EF2(EF-G), который, как указывалось выше, необходим для GTP-зависимой транслокации. Фусидовая кислота не влияет на взаимодействие фактора EF2(EF-G) и GTP с пре-транслоцированной рибосомой и последующее расщепление GTP. По-видимому, антибиотик препятствует диссоциации указанного комплекса и сопряженной с ней

200

транслокации. По тому же механизму фусидовая кислота подавляет трансляцию эукариотическими рибосомами.

Тетрациклины. Антибиотики тетрациклинового ряда специфически связываются с 30S субчастицей рибосом, подавляя реакцию аминоацил-тРНК с рибосомами и свободными 30S субчастицами в присутствии матрицы, но не нарушая связывание самого матричного полинуклеотида. Предполагают, что тетрациклины взаимодействуют с акцепторным тРНК-связывающим участком 30S субчастицы рибосом.

Стрептомицин и другие аминогликозидные антибиотики.

Стрептомицин (антибиотик углеводной природы) специфически взаимодействует с определенным структурным белком 30S субчастицы рибосом, блокируя стадию инициации трансляции. В присутствии стрептомицина наблюдается стимуляция связывания аминоацил-тРНК, не соответствующих кодонам мРНК, находящимся в данный момент в акцепторном A-участке рибосом. В итоге происходит ошибочное включение аминокислот в полипептидные цепи синтезируемых белков. Это может проявляться в фенотипической супрессии нонсенс-мутаций у мутантных бактерий. Аминогликозидные антибиотики также вызывают неспецифическое связывание матричных полинуклеотидов рибосомами. Следствием является, например трансляция одноцепочечных ДНК рибосомами в бесклеточных системах в присутствии аминогликозидов.

2.5. Трансляция у эукариот

Бактерии обладают единственной универсальной системой трансляции, основные механизмы функционирования которой были кратко рассмотрены выше. В отличие от этого, клетки животных кроме основной системы трансляции, локализованной в цитоплазме, имеют дополнительную систему трансляции митохондрий, которая по ряду свойств приближается к бактериальной. Клетки растений обладают еще одной дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах. Большинство данных о механизмах биосинтеза белка у эукариот было получено с использованием бесклеточных белоксинтезирующих систем (подробнее о принципах функционирования таких систем см. в разделе 7.4). В последнее время важные результаты о механизмах трансляции у эукариот были получены