Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

1 / 131 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

Российский государственный педагогический

университет им. А. И. Герцена

Н. В. Цымбаленко

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Часть I

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК

Допущено Учебно-методическим объединением

по направлениям педагогического образования

Министерства образования и науки РФ

в качестве учебного пособия

для студентов высших учебных заведений,

обучающихся по направлению

«050100 — Естественнонаучное образование»

Санкт-Петербург

Издательство РГПУ им. А. И. Герцена

2011

ББК 28я73 Ц 93

Печатается по рекомендации кафедры зоологии и решению редакционно-издательского совета РГПУ им. А. И. Герцена

Рецензенты: д-р биол. наук, проф. Г. Л. Атаев (РГПУ им. А. И. Герцена);

д-р биол. наук, проф. Н. В. Кириллова (Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

Цымбаленко Н. В.

Ц 93 Биотехнология. Ч. 1. Технология рекомбинантной ДНК: Учебное

пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов). — СПб.: Изд-во РГПУ им. А. И. Герцена,

2011. — 127 с.

ISBN 978–5–8064–1697–2

Материал, представленный в данном учебном пособии, познакомит студентов биологических специальностей педагогических вузов с современными методами технологии создания и применения рекомбинантных ДНК для фундаментальных и прикладных целей, а также поможет понять основные молекулярные принципы, на которых базируется биотехнология.

Объем и глубина излагаемого в пособии материала определяется учебными курсами по биотехнологии, которые с 2005 года автор пособия читает студентам факультета биологии РГПУ им. А. И. Герцена.

ISBN 978–5–8064–1697–2

ББК 28я73

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие ....................................................................................................... 5

Введение ............................................................................................................. 8

Ферменты — инструменты генетической инженерии ..................................... 13

Эндонуклеазы рестрикции .............................................................................. 14

Номенклатура .......................................................................................... 15

Ферментативная активность компонентов системы рестрик-

ции-модификации ................................................................................... 16

Классификация эндонуклеаз рестрикции .............................................. 17

Эндонуклеазы рестрикции типа II.......................................................... 18

Физическое картирование ДНК по участкам узнавания эн-

донуклеаз рестрикции ............................................................................. 20

Полимеразы ..................................................................................................... 26

Обратная транскриптаза .................................................................................. 30

Способы объединения фрагментов ДНК ............................................................ 34

Лигирование по одноименным липким концам ............................................. 34

Лигирование по одноименным липким концам с обработкой ще-

лочной фосфатазой .......................................................................................... 35

Лигирование по тупым концам ....................................................................... 37

Лигирование фрагментов с разноименными липкими или липким

и тупым концами ............................................................................................. 38

Генетические векторы для клонирования ДНК ............................................... 40

Вставки ДНК .................................................................................................... 41

Векторы для клонирования ДНК .................................................................... 42

Плазмидные векторы ....................................................................................... 43

Плазмидный вектор pBR322 ................................................................... 43

Введение рекомбинантной ДНК в клетки бактерий и отбор

трансформантов ...................................................................................... 46

Другие плазмидные векторы .................................................................. 48

Векторы на основе бактериофага λ................................................................. 51

Гибридные векторы ......................................................................................... 54

Векторные системы для клонирования очень крупных фрагмен-

тов ДНК ............................................................................................................ 55

Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК ........................ 59

Химический синтез ДНК................................................................................. 59

Секвенирование ДНК ...................................................................................... 66

Молекулярная гибридизация .......................................................................... 73

Гибридизация нуклиновых кислот в растворе ...................................... 73

Гибридизация нуклиновых кислот на твердых подложках .................. 74

Гибридизация на чипах ........................................................................... 76

Полимеразная цепная реакция ........................................................................ 77

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) ........................................ 77

ПЦР в реальном времени ........................................................................ 80

Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цеп-

ной реакцией (ОТ-ПЦР) .......................................................................... 83

Направленный мутагенез ................................................................................ 84

Библиотеки генов ................................................................................................... 86

Создание геномных библиотек. Прокариоты................................................. 86

Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации ................................... 89

Иммунологический скрининг ................................................................. 91

Скрининг по активности белка............................................................... 92

Клонирование структурных генов эукариот .................................................. 93

Системы экспрессии чужеродных генов ............................................................ 95

Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид ........................... 95

Экспрессия генов, интегрированных в хромосомную ДНК прока-

риот .................................................................................................................. 98

Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических системах ................ 99

Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитаю-

щих (ЭВМ) ..................................................................................................... 101

Химерные белки ................................................................................................... 103

Репортерные гены.......................................................................................... 104

Другие области применения химерных белков ........................................... 105

Повышение эффективности секреции .......................................................... 107

Словарь терминов ......................................................................................... 108

Список используемой литературы ............................................................... 127

Предисловие

Дисциплина «Биотехнология» принадлежит к национально-

региональному (вузовскому) компоненту цикла общепрофессиональных дисциплин (ОПД.Р.02) государственного образовательного стандарта 2005 года по направлениям 050100.62 и 050100.68 («Естественнонаучное образование»).

Цель дисциплины: обеспечить приобретение профессиональной ком-

петентности в области биотехнологии путем формирования системы знаний и представлений о данной отрасли как одном из современных наукоемких направлений деятельности человека, которое базируется на обширных фундаментальных знаниях физики, химии, биологии, медицины, технологии производства, экологии, социологии и права.

Задачи дисциплины:

• ознакомить студентов с основами молекулярной биотехнологии;

• сформировать у студентов общенаучные (информационные) компе-

тенции в области биотехнологии;

• сформировать у студентов инструментальные компетенции;

• сформировать коммуникативные, социально-личностные и обще-

культурные компетенции студентов.

Компетенции, в развитие которых вносит вклад данная дисциплина: а) общенаучные (информационные): – сформировать систему знаний об основных достижениях общебио-

логических наук (биохимии, общей генетики, микробиологии, цитологии, физиологии, молекулярной биологии), используемых в биотехнологии;

– сформировать представление о современном состоянии отраслей

биотехнологии и их влиянии на жизнь человека;

– обеспечить овладение знаниями по основам молекулярной биотех-

нологии;

– обеспечить становление представлений о методах современных

биотехнологических исследований и знакомство с современными методами технологии рекомбинантных ДНК, на которых базируется развитие прикладной биотехнологии;

– обеспечить овладение практическими умениями и навыками про-

фессиональной оценки достижений биотехнологии, включая их практическую ценность, целесообразность, этическую допустимость и правовую обеспеченность;

– выработать умения и навыки самостоятельного приобретения зна-

ний в области биотехнологии, переработки и адаптации информации к различным уровням образований в соответствии с принципами научности и доступности;

б) инструментальные компетенции: – обеспечить овладение подходами и методами, используемыми в

биотехнологии (методы технологии рекомбинантной ДНК, культивирования клеток и тканей; статистический и компьютерный анализ данных);

– обеспечить овладение современными информационными и комму-

никативными технологиями для поиска, хранения и представления информации по проблемам биотехнологии;

– способствовать развитию способностей к творчеству, научно-

исследовательской работе, самостоятельной работе с литературой и анализу получаемой информации для применения ее в дальнейшей практической деятельности;

– сформировать умение критически оценивать достоинства и потен-

циальные опасности новых или модифицированных биотехнологических разработок;

в) коммуникативные, социально-личностные и общекультурные ком-

петенции:

– развить способности к адаптации в современной информационной

среде по нанотехнологиям;

– обеспечить овладение терминологией и основами речевой комму-

никации в профессиональной среде, сформировать навыки обсуждения современного состояния биотехнологии;

– сформировать умения работы в группе; подготовить студентов к

профессиональной деятельности в научно-исследовательском и педагогическом коллективах;

– сформировать представление о биотехнологии как мощном факторе

адаптивной эволюции человека, ускоряющем масштабы антропогенного воздействия на живую природу.

Настоящее учебное пособие включает материал по молекулярной

биотехнологии, который позволит обеспечить студентам биологических специальностей педагогического вуза знакомство с современными методами технологии создания и применения рекомбинантных ДНК для фундаментальных и прикладных целей, а также поможет понять основные молекулярные принципы, на которых базируется биотехнология.

Объем и глубина излагаемой в пособии информации определяются

учебными курсами по биотехнологии, которые с 2005 года автор пособия читает студентам факультета биологии РГПУ им. А. И. Герцена.

Введение

Технология рекомбинантной ДНК (ее называют также молекуляр-

ным клонированием, или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой (Глик Б. и Пастернак Дж). Другими словами, это получение новых комбинаций генетического материала пу- тем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном по заранее

заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследо-

вателей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. В 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик, основываясь на многочисленном фактическом материале по химии нуклеиновых кислот и рентгеноструктурному анализу ДНК, создали двуспиральную модель структуры

ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50–60-х годов были выяснены свойства генетического

кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы (бактериофаги) и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Таким образом, предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестрицирующим эндонуклеазам и ДНКлигазам.

Технология рекомбинантной ДНК является важной составной ча-

стью биотехнологии, поэтому ее часто называют молекулярной биотехнологией. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы молекулярной биотехнологии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В качестве примера можно привести биотехнологическое производство соматотропина.

Соматотропин — гормон роста человека, секретируемый гипо-

физом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4–6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом,

был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания «Genentec» (США) в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции.

В 1978 году исследователи из компании «Genentec» впервые по-

лучили в специально сконструированном штамме кишечной палочки другой гормон — инсулин, а с 1984 года было начато промышленное производство этого необходимого медицинского препарата и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высо-

коспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями у разных организмов. ДНК-зонды также используют в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок — ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, открывается возможность «исправлять» дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку,

могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомкам. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка, в зиготу кролика по-

1 / 131 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]