Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
сти процедуры и ее удешевлении. Для этого нужно было исключить
этапы разделения, занимающие много времени, миниатюризировать
всю систему, сохранив при этом возможность прочитывать последовательности миллионов фрагментов.
Рис. 38. Принципиальная схема
определения первичной последовательности ДНК
с помощью автоматического секвенатора
Следует также упомянуть и другие методы секвенирования при
помощи биосинтеза, основанные на тех стадиях упомянутого процесса, которые протекают на одиночной цепи секвенируемой ДНК. В одном из таких подходов регистрируется момент присоединения к
праймеру, гибридизовавшемуся с ДНК-матрицей, комплементарного
нуклеотида (удлинение цепи). В другом — момент сшивания лигазой
праймера с олигонуклеотидным зондом, содержащего известный нуклеотид в определенной позиции.
Существуют разные способы регистрации данных процессов, но
обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, как было рассмотрено
71
выше, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины
волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования.
Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой (его синтезируют хорошо знакомые нам светлячки) пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида.
Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип — физическое различие между нуклеотидами А, Т, G и
С (рис. 39).
Рис. 39. Схема секвенирования с применением нанопор
Отрицательно заряженная одноцепочечная ДНК проходит через
нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несет
отрицательный заряд, а внутренняя — положительный.
72
Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром
1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение элек-
тропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение
электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи.
Молекулярная гибридизация
Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе
Известно, что при нагревании водного раствора ДНК до 100°С,
а также при повышении рН до 13 двойная спираль ДНК денатурирует за счет разрушения водородных связей между основаниями
антипараллельных комплементарных полинуклеотидных цепей.
В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65°С вело к восстановлению структуры
двойной спирали. Процесс восстановления структуры ДНК называется ренатурацией, или гибридизацией. Процесс гибридизации, то
есть образования водородных связей между основаниями нуклеотидов, происходит между любыми одноцепочечными полинуклеотидами, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК
(рис. 40).
Рис. 40. Схема гибридизации полинуклеотидных цепей
73
Можно выделить основные этапы проведения экспериментов по
гибридизации нуклеиновых кислот.
1. Двухцепочечную ДНК нагревают в соответствующем буфере.
Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически
невыгодными и цепочки полинуклеотидов расходятся.
2. Препарат денатурированных ДНК затем смешивают с другой
денатурированной ДНК или РНК.
3. Препараты далее медленно охлаждают, при этом одноцепочеч-
ные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи
между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная молекула».
Анализ скорости отжига одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами
или особями одного вида. Кроме того, гибридизация нуклеиновых
кислот представляет собой высокочувствительный метод выявления
специфических последовательностей нуклеотидов и применяется в
различных модификациях как в растворе, так и на твердых подложках, например на нитроцеллюлозных фильтрах или нейлоновых мембранах.
Гибридизация нуклеиновых кислот на твердых подложках
Обобщенная схема гибридизационного анализа на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 41) включает следующие этапы.
1. Подготовка исследуемой ДНК для фиксации на нитроцеллю-
лозном фильтре. Обычно исследуемую ДНК фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции и фракционируют полученные фрагменты ДНК методом гельэлектрофореза в агарозе (рис. 41, 1). Гель
помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной фильтра для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
2. Нитроцеллюлозный фильтр помещают сверху агарозного геля
таким образом, чтобы осуществлялось полное соприкосновение
фильтра и геля (рис. 41, 2). Сверху фильтра кладут несколько слоев
фильтровальной бумаги и небольшой груз, чтобы обеспечить возникновение капиллярного тока жидкости через гель на фильтр. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием
воды (из губки, смоченной щелочным раствором) в зону с низким со-
74
держанием воды — на нитроцеллюлозный фильтр. При этом происходит и перенос ДНК из геля на фильтр. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженным нитроцеллюлозным фильтром силами ионообменных взаимодействий.
Рис. 41. Схема гибридизации нуклеиновых кислот
на нитроцеллюлозных фильтрах (гибридизация по Саузерну)
3. Для окончательного закрепления ДНК на фильтре его нагрева-
ют в вакууме до температуры 80°С в течение двух часов. В случае использования нейлоновых мембран, последнюю освещают ультрафиолетовым излучением.
4. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при
определенных условиях (температуре и ионной силе) образует водородные связи с ДНК-мишенью (рис. 41, 3).
5. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося
меченого ДНК-зонда.
6. Детекция гибридных молекул зонд/мишень с помощью специ-
фичной и высокочувствительной системы (радиоактивной, хемилюминесцентной, флуоресцентной) (рис. 41, 4).
Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в литературе термины «Нозерн-блоттинг» и «Вестернблоттинг» относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти
75
названия — в переводе с английского «северный» и «западный» — не
имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern — южный). Тем самым они
как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не
только физики, но и биологи.
Гибридизация на чипах
Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными мечеными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка
может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в
определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце
есть последовательности, комплементарные последовательностям
зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью
специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной
диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов,
установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК, или кДНК, полученных на мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ.
Как исследовать, действительно ли ген существует, то есть
транскрибируется ли данный участок ДНК? Для этого ген представляют в чипе частью его последовательности — олигонуклеотидом,
который иммобилизован в микроплощадке с определенными координатами на этой матрице (рис. 42, 1). Этот олигонуклеотид соответствует части экзона, предсказанного компьютером на основе сиквенса
геномной ДНК. Чтобы выяснить, действительно ли геном в данном
участке транскрибируется, берется клетка и из нее выделяется суммарная РНК (рис. 42, 2). Из всех этих молекул РНК получают ДНКкопии, которые флуоресцентно метят и проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами (рис. 42, 3, 4).
Если в данных условиях какие-то площадки с олигонуклеотидами
«молчат» (они показаны черным), то это значит, что участок геномной последовательности, комплементарной этому олигонуклеотиду,
не транскрибируется. Если же площадка матрицы «светится», значит,
76
олигонуклеотиды в этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченным продуктом, то есть соответствующий участок генома транскрибировался и действительно является частью какого-то гена (рис. 42, 5).
Рис. 42. Схема анализа последовательностей нуклеотидов
с помощью ДНК-чипов
Биологические микрочипы могут быть использованы для установления относительного уровня экспрессии в клетках различных типов для выявления органоспецифических различий (печень — почки),
патологических (норма — опухоль), онтогенетических (зародыш —
взрослый организм).
Полимеразная цепная реакция
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (polymerase chain reaction — PCR) был разработан Кэри Мюллисом (фирма
«Cetus», США) в 1983 году. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции.
В настоящее время ПЦР широко используется как для научных исследований, так и для решения прикладных задач (генотипирование,
диагностика инфекционных заболеваний, судебная медэкспертиза
и т. д.).
77
Этот метод представляет собой эффективный способ получения
in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация (увеличение числа копий) — иногда
в миллионы раз — осуществляется в ходе трехэтапного циклического
процесса. Для осуществления ПЦР необходимы:
– два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной 20–
25 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противополож-
ных цепей, фланкирующим последовательность-мишень; их 3’-ОН
концы должны быть ориентированы навстречу друг другу;
– ДНК-матрица длиной от 100 до 35 000 п. н. (ДНК или ее часть,
содержащая искомый специфический фрагмент);
– термостабильная ДНК-полимераза, которая не теряет своей
активности при температуре 95°С и выше;
– смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (смесь четырех дНТФ
является субстратом для синтеза новых комплементарных цепей
ДНК);
– буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg
2+,
необходимые для поддержания активности фермента).
Стандартная ПЦР-амплификация представляет собой многократное повторение следующих трех реакций (рис. 43, 1).
1. Денатурация образца ДНК выдерживанием его при температуре 93–95°С в течение по крайней мере 1 минуты. Помимо ДНК в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерии Termus aquaticus, и
четыре дНТФ.
2. Ренатурация, или отжиг. Температуру смеси медленно понижают до оптимальной температуры спаривания матрицы ДНК и
праймеров. Присоединение праймеров происходит комплементарно к
соответствующим последовательностям на границах специфического
участка противоположных цепей ДНК. Для каждой пары праймеров
существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65°С. Время отжига занимает 20–60 с.
3. Синтез ДНК или удлинение праймера. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения
праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (англ. dNTPs).
Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-
78
полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70–
72°С. Время протекания синтеза — 20–60 с.
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК
служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ам-
пликона) (рис. 43, 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом,
происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где
n — число циклов амлификации. Поэтому даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Такого количества достаточно для достоверной
визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.
Рис. 43. Схема первых трех циклов полимеразной цепной реакции
79
Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе
автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
Амплифицированный in vitro специфический фрагмент ДНК получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования,
то есть для определения последовательности нуклеотидов в его цепи.
Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования
фрагмента ДНК в генетических векторах, ПЦР иногда называют бес-
клеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).
Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции,
состоящая из 30 и более циклов, занимает 3–4 часа, что существенно
быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента
ДНК в составе рекомбинантных ДНК.
Метод ПЦР произвел настоящую революцию в биотехнологии.
Он позволяет в миллионы раз амплифицировать in vitro нужные сегменты ДНК.
Некоторые из направлений применения метода ПЦР:
• идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей
заболеваний человека, животных и растений;
• выявление спонтанных мутаций;
• внесение специфических мутаций in vitro (направленный мута-
генез);
• введение адаптеров для создания сайтов рестрикции в ампли-
фицированных фрагментах с дальнейшим клонированием последних,
например, в клетках E.coli (рис. 44);
• сборка полноразмерных генов из синтетических олигонуклео-
тидов;
• секвенирование ДНК и др.
ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.
ПЦР в реальном времени
В настоящее время широкое распространение в исследовательских и диагностических лабораториях получила новая технология
ПЦР — ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиаль-
ной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая
регистрация и интерпретация полученных результатов (рис. 45).
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]