Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
Если вектор функционирует как плазмида, реплицикация которой
не зависит от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации
репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор
предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то
для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность,
гомологичную определенному участку хромосомной ДНК хозяина
(хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Это значит, что эти векторы несут два
типа сайтов инициации транскрипции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Escherichia coli, a
другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные
системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток
млекопитающих.
Экспрессирующие векторы
для работы с клетками млекопитающих
Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих
(ЭВМ)
используются для изучения функций и регуляции генов млеко-
питающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут быть
применимы в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний
человека. Уже сконструированные экспрессирующие векторы млекопитающих весьма многочисленны, но все они обладают сходными
свойствами и похожи на другие эукариотические экспрессирующие
векторы (рис. 56).
Полилинкер, представляющий собой множественный сайт клонирования (МСК), и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора и сигнала полиаденилирования или
терминации. Обычно используют регуляторные последовательности
ДНК вирусов животных (например, цитомегаловируса человека, SV40
или HSV) или генов млекопитающих (гена β-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или гена гормона роста). Репликация в клетках
E.coli и в клетках млекопитающих обеспечивается соответствующими
сайтами инициации репликации: ori плазмиды colEI и, например,
обезьяньего вируса 40 (SV40). Для отбора трансформированных клеток E.coli используется ген устойчивости к ампициллину Amp. В ка-
101
честве селективных маркеров для трансфицированных клеток млекопитающих используют разные гены:
1. Бактериальный ген Neo, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, которая обеспечивает устойчивость трансфецированных клеток к токсичному соединению генетицин (G-418).
2. Ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР). В этой системе используют клетки с дефектом гена ДГФР, которые не способны
расти на среде с метотрексатом. Отобранные клетки пересевают на
среды с большей концентрацией метотрексата, отбирая таким образом более устойчивые клетки, то есть содержащие больше копий вектора.
3. Ген фермента глутаминсинтетазы (GS), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина.
Вектор, содержащий GS-ген, вводят в культуру клеток млекопитающих и для отбора клеток, несущих большое количество копий вектора, повышают концентрацию метионинсульфоксимина в среде. При
этом в хозяйских клетках тоже должна присутствовать GS, поскольку
только множественные копии GS-гена могут обеспечивать устойчивость к метионинсульфоксимину.
102
ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ
Стабильность продукта экспрессии гена-интереса в хозяйской
клетке также программируют на стадии конструирования рекомбинантной ДНК. Один из способов защиты продуктов экспрессии чужеродных генов (белков) от деградации в хозяйских клетках — ковалентное присоединение продукта клонированного гена к какому-либо
стабильному белку хозяина. Подобная конструкция получила название химерный белок, или слитый белок. Слияние белков программи-
руется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. При этом следует помнить о рамке считывания,
поскольку теоретически нуклеотидная последовательность мРНК в
процессе трансляции может быть декодирована с помощью любой из
трех различных рамок считывания, причем образующиеся полипептидные цепи будут в этих трех случаях совершенно разными.
В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, что встречается нечасто.
Для удаления балластной (хозяйской) белковой последовательности из химерного белка на уровне ДНК программируют введение сайтов узнавания для протеаз. Олигонуклеотидные линкеры, несущие такие сайты, можно пришить к клонированному гену до того, как такая
конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему
слияния. Линкером может служить, например, последовательность
нуклеотидов, кодирующая олигопептид Ile-Glu-Gly-Arg, узнаваемый
фактором крови Ха, который является специфической протеинкиназой (рис. 57).
Создание подобных химерных конструкций широко используется
также для контроля за уровнем экспрессии вводимого гена и для определения места локализации его продукта в клетке-хозяине. В этом
случае последовательности гена-мишени сливают с генами, которые
103
кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях
может быть легко тестировано. Они получили название репортерные
гены.
Рис. 57. Пример встраивания в рекомбинантную ДНК
линкерной последовательности, кодирующей внутри слитого белка сайт,
узнаваемый специфической протеинкиназой
Репортерные гены
Чаще всего в качестве репортерных используют гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и др.
GFP (green fluorescent protein — зеленый флюоресцентный белок,
или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавторами в 1962 году у люминесцирующей медузы Aequorea victoria.
В 2008 году Нобелевская премия по химии была присуждена группе
ученых из США: Osamu Shimomura, Martin Chalfie и Roger Tsien за
«открытие и исследование зеленого флюоресцирующего белка», который стал одним из важнейших исследовательских инструментов в
биологии, так как позволяет вести наблюдения за процессами в живых клетках.
Особые свойства белка GFP, а именно его способность флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ, обусловлены самой структурой его молекулы и не
требуют субстратов или кофакторов.
Многочисленные производные GFP получили общее название
AFP (autofluorescent proteins — автофлюоресцентные белки). На рисунке 58 представлены эукариотические клетки, трансфецированные
плазмидной ДНК, содержащей в своей структуре гены зеленого (А) и
красного (Б) флуоресцирующих белков.
104
Рис. 58. Клетки линии НЕК-293, трансфецированные плазмидными ДНК,
которые содержат репортерные гены
зеленого (А) и красного (Б) флуоресцирующих белков.
Фотографии сделаны на лазерном сканирующем
конфокальном микроскопе «Leica SP2»
(увеличение в 400 раз)
Область применения репортерных генов включает контроль переноса и экспрессии чужеродных генов, а также временные и пространственные особенности экспрессии данного конкретного гена,
как чужеродного клетке-реципиенту, так и ее собственного.
Другие области применения химерных белков
Методический прием создания конструкции ДНК с программируемым синтезом продукта в составе химерного белка используют
также и для упрощения процедуры очистки рекомбинантного белка.
Например, плазмидная конструкция для клеток S.cerevisiae, содержащая ген человеческого интерлейкина-2 с присоединенным к нему
сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид Asp-Tyr-Lys-AspAsp-Asp-Asp-Lys (он продается под названием Flag), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку. Химерный белок, образующийся после экспрессии этой конструкции в дрожжевых клетках, может быть
очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии
(рис. 59).
Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на
твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Мар-
105
керный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с
антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку.
Очищенный химерный белок элюируют из колонки.
Рис. 59. Очистка химерного белка
с помощью иммуноаффинной хроматографии
Для скрининга обширных (до 5 × 10 клонов) библиотек комплементарные ДНК (кДНК), кодирующих редко встречающиеся белки,
были разработаны специальные системы слияния. Обычно кДНК
встраивают в гены поверхностных белков (белков филаментов или
пилей) нитчатых бактериофагов (например М13) или бактерий и после транскрипции и трансляции получают химерные белки, входящие
в состав поверхностных структур этих микроорганизмов, где их идентифицируют иммунологически (рис. 60).
106
Рис. 60. Химерные белки, состоящие из поверхностного бактериального белка
и чужеродного белка-мишени, присоединенного к его N- или С-концу (А)
либо включенного в экспонируемые участки молекулы (Б)
Повышение эффективности секреции
Стабильность белков, кодируемых клонированными генами, и
простота процедуры очистки зависят от их клеточной локализации.
Накапливающиеся в клетке-продуценте чужеродные белки чаще всего
приводят к гибели клетки, что снижает эффективность получения конечного продукта из-за необходимости постоянного рекультивирования продуцента. Предпочтительнее использовать клетки, секретирующие конечный продукт в среду культивирования. Транспорт
белков через клеточную мембрану обеспечивают N-концевые аминокислотные последовательности — сигнальные пептиды. Иногда удается сделать белок секретируемым, присоединив к кодирующему его
гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез
сигнального пептида для секреции.
107
Словарь используемых терминов
Агароза. Получаемый из агара линейный полисахарид, образо-
ванный из чередующихся остатков B-D-галактопиранозы и 3,6-
ангидридо-α-1-галактопиранозы, объединенных 1 4 связью. Обладает ярко выраженным свойством к формированию гелей. Точка плавления — 95°C, точка образования геля — 45°C.
Аденин (A). Пуриновое основание, комплементарное тимину
и урацилу. Одно из азотистых оснований, входящих в состав ДНК
и РНК.
Адаптер. 1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с
одним тупым концом и одним липким. После пришивания адаптера
тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец.
2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после
самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для
рестрицируюшей эндонуклеазы. Когда адаптер встраивают в клонирующий вектор, у последнего появляется новый сайт рестрикции.
Амидофосфиты. Модифицированные нуклеозиды, содержащие
активированные линкерные группы — новые мономеры для синтеза
модифицированных олигонуклеотидов. Применяются для химического синтеза олигонуклеотидов.
Аминокислота. Мономерная единица белковых молекул.
Ампликон. Специфический продукт ПЦР, накапливающийся в
реакционной смеси начиная со второго цикла. Ампликоны ограничены по длине двумя праймерами.
Амплификатор. Прибор для проведения полимеразной цепной
реакции.
108
Амплификация. Увеличение числа копий участка ДНК в полимеразной цепной реакции.
Антибиотик. Вещество, синтезируемое одним микроорганизмом
и оказывающее ингибирующее действие на другие микроорганизмы и
раковые клетки.
Антиген. Вещество, воспринимаемое организмом как чужеродное и вызывающее специфический иммунный ответ — выработку антител.
Αнтипараллельная ориентация. Противоположная направленность (5'→3' и 3'→5') цепей в двухцепочечных молекулах нуклеино-
вых кислот.
Антитело. Белок (иммуноглобулин), синтезируемый B-лимфоцитами в ответ на попадание в организм различных антигенов и специфически с ними взаимодействующий.
Бактериофаг. Вирус, инфицирующий бактерии.
Библиотека кДНК. Коллекция клонов кДНК, синтезируемых in
vitro на матрицах мРНК, происходящих из одной ткани или клеточной
популяции.
Биотинное мечение. 1. Присоединение молекулы биотина к молекуле другого вещества. 2. Включение биотинсодержащего нуклеотида в молекулу ДНК.
Блоттинг. Перенос разделенных молекул из одной среды (например, геля) на твердый носитель(бумагу, нитроцеллюлозный фильтр).
Брешь (пробел). Отсутствие одного или нескольких нуклеотидов
в одной из цепей двухцепочечной ДНК.
Бромистый этидий. 3,8-диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум
бромид, EtBr, Ethidium bromide — интеркалирующий агент, широко
применяемый для выявления нуклеиновых кислот в молекулярной
биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле.
Вектор (генетический). Самореплицирующаяся молекула ДНК
(например, бактериальная плазмида), используемая в генной инжене-
рии для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент, а
также для клонирования нуклеотидных последовательностей.
Вставка ДНК. Сегмент ДНК, встроенный в клонирующий вектор.
Вторые антитела. Антитела к комплексу «антиген — первое ан-
титело». Как правило, вторые антитела коньюгированы с одним из
109
компонентов системы детекции получаемого комплекса «антигенпервое антитело — второе антитело», например — ферментом. Последний способствует образованию в среде хромогенного продукта,
который позволяет визуализировать указанный комплекс.
Ген. Транскрибируемый участок хромосомы, кодирующий функциональный белок либо тРНК, или рРНК.
Генетический код. Система записи генетической информации в
виде последовательности нуклеотидов, в которой каждые три нуклеотида, составляющие кодон, кодируют одну аминокислоту или являются сигналом остановки процесса синтеза полипептида. Состоит из
64 кодонов, кодирующих все 20 аминокислот и три терминирующих
кодона.
Ген-мишень. l. Клонированный ген. 2. Ген, подвергаемый специфическому воздействию. 3. Ген, интересующий исследователя.
Геномная библиотека (банк или библиотека генов). Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном.
Генотип. Набор всех генов организма.
Ген-регулятор. Ген, кодирующий белок-репрессор, который свя-
зывается с оператором и регулирует транскрипцию «своего» оперона.
Ген-репортер. Ген, кодирующий легко выявляемый продукт. Такие гены используют, например, для того, чтобы убедиться, что данная генетическая конструкция успешно введена в клетку, орган или
ткань.
Гетерологичный зонд. Сегмент ДНК одного организма, использующийся для скрининга библиотеки сходных ДНК другого организма.
Гетероизошизомеры. Рестрицирующие эндонуклеазы, выде-
ленные из различных микроорганизмов, которые узнают на ДНК
одни и те же последовательности, но производят разрывы в разных
точках в пределах того же сайта. Например: XmaI (C↓CCGGG) и
SmaI (CCC↓GGG).
Гибридизация нуклеиновых кислот. Отжиг двух полинуклео-
тидных цепей, часто из разных источников, с образованием
ДНК/РНК- или ДНК/ДНК-гибридов, стабилизируемых водородными
связями.
Гибридный белок (химерный белок, слитый белок). Продукт
клонированных совместно двух или более кодирующих последова-
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]