Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
Рис. 44. Введение сайтов рестрикции с помощью ПЦР
Рис. 45. Кинетическая кривая ПЦР в координатах:
1 — стадия инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируется
флуоресцентной меткой); 2 — экспоненциальная стадия (в которой
наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции
от цикла ПЦР); 3 — плато — стадия насыщения
81
Real-time PCR — это семейство методик количественного ПЦР со
следующими чертами:
– определение выхода продукта реакции после каждого цикла
амплификации;
– построение по этим данным кинетической кривой ПЦР;
– определение относительной концентрации субстрата на осно-
вании анализа этой кривой.
ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченные
олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации (рис. 46). Детектируемая прибором флуоресценция прямо
пропорциональна количеству ПЦР-продукта, ее обозначают как ре-
портерная флуоресценця. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time ПЦР.
Рис. 46. Схема, представляющая систему использования флуорфоров
при проведении ПЦР в реальном времени
Детекция сигнала флуоресценции в ходе реакции позволяет наблюдать процесс накопления продукта во время ПЦР, а не после
82
окончания реакции. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает
пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг
сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом
момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового — так
называемый пороговый цикл — зависит от исходного количества
ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше
наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Основные преимущества ПЦР в реальном времени по сравнению
с методом анализа по конечной точке:
•
количественный анализ специфической ДНК в широком диапа-
зоне концентраций;
•
сравнительный количественный анализ нескольких типов ДНК
в одной пробирке;
•
повышение специфичности реакции за счет использования
гибридизационных зондов;
•
обнаружение и определение процентного содержания ДНК с
измененной последовательностью;
•
исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом и, как следствие, снижение риска контаминации (загрязнения),
экономия времени и сокращение затрат на поддержание ПЦРлаборатории;
•
автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа.
Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цеп-
ной реакцией (ОТ-ПЦР)
Метод ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR — reverse transcription polymerase
chain reaction) представляет собой метод амплификации специфиче-
ского фрагмента рибонуклеиновой кислоты. Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) и далее амплифицируют уже
одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционный метод
ПЦР. Для превращения последовательности РНК в комплементарную
ДНК использут фермент обратную транскриптазу (см. раздел «Ферменты — инструменты генетической инженерии»).
Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является
чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется
для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного
83
определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.
Направленный мутагенез
Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства природных белков
часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их
промышленного применения. Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать подход, основанный на внесении
изменений в кодирующие их клонированные гены, то есть путем
осуществления мутагенеза. Это позволяет получать белки с другими,
чем у их аналогов, свойствами.
Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется сайт-направленным му-
тагенезом. В 1993 году Смит (Michael Smith) вместе с Мюллисом
(Kary Mullis) получили Нобелевскую премию «за фундаментальный
вклад в установление направленного мутагенеза, основанного на олигонуклеотидах, и за его развитие для изучения белков».
В настоящее время в технологии рекомбинантной ДНК наиболее
часто используют два методических подхода сайт-направленного мутагенеза. Первый из них (рис. 47) включает встраивание ДНК-мишени
в плазмидный вектор, которым трансформируют клетки E. coli, выделяют клонированную и двухцепочечную плазмидную ДНК и денатурируют щелочью, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с синтезированным
химическим путем олигонуклеотидом с измененной последовательностью нуклеотидов, например с однонуклеотидной заменой в заранее определенном месте. Гибридизовавшийся олигонуклеотид служит
затравкой для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула ДНК —
матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи
зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки E. coli. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации.
84
Рис. 47. Сайт-направленный мутагенез
с использованием плазмидной ДНК
Второй подход позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием пары праймеров, со встроенным «мутантным»
нуклеотидом. Cинтезируют пару праймеров, несущих мутацию, и пару праймеров, комплементарных концам нужного фрагмента ДНК.
В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией,
которые объединяют в третьей реакции. Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию.
85
БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ
Идентификация нуклеотидных последовательностей, как структурных, кодирующих определенные белки, так и регуляторных, обеспечивающих реализацию генетической информации, является конечной целью многих фундаментальных исследований и базой для
прикладных протоколов в биотехнологии. В связи с этим разработаны
подходы для создания доступных для работы библиотек ДНК. Создание библиотеки ДНК (банка клонов, банка генов) представляет собой
процесс клонирования фрагментов ДНК. Существуют два типа библиотек ДНК: геномные библиотеки и кДНК-библиотеки.
Геномные библиотеки содержат все последовательности ДНК,
представляющие полный геном данного организма.
кДНК-библиотеки представляют собой только последовательности комплементарных ДНК, синтезированных на РНК данных клеток.
Создание геномных библиотек. Прокариоты
Разделение геномной ДНК на клонируемые элементы и введение
этих элементов в клетки-хозяева дают возможность получить полную
библиотеку генов данного организма. Специфика структурной организации генов прокариот и эукариот инициирует разработку и применение различной стратегии для их клонирования.
У прокариот искомая нуклеотидная последовательность (ДНК-
мишень или ДНК интереса) часто составляет минимальную часть
(0,02%) суммарной хромосомной ДНК. Для экстрагирования после-
довательности ДНК-мишени разработаны различные экспериментальные подходы, включающие следующие основные этапы:
– суммарную ДНК гидролизуют эндонуклеазами рестрикции и
каждый из полученных фрагментов встраивают в вектор;
– проводят поиск специфической клеточной линии (клона), которая содержит нужную последовательность нуклеотидов;
–
выделяют ДНК и анализируют.
86
Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке
донорной ДНК эндонуклеазой рестрикции, узнающей тетрануклеотиды, например Sau3AI, которая вносит один разрыв примерно на 256
пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты
различных размеров.
Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени
инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке 48, расщеплены по всем сайтам, имеющимся на данной ДНК для гипотетической рестрицирующей эндонуклеазы (REIсайтам), другие — только по некоторым.
Рис. 48. Схема проведения частичного гидролиза фрагмента ДНК
эндонуклеазой рестрикции типа II
Из рисунка 48 видно, что исследователь получает набор фрагментов ДНК всевозможного размера и, что самое ценное, получает возможность экстрагировать последовательности ДНК, содержащие нативные, то есть не фрагментированные участки. Например, при
полном гидролизе с помощью REI исследуемый фрагмент ДНК гидролизуется по всем REI-сайтам, встречающимся на составляющей его
нуклеотидной последовательности, образуя фрагменты a, b, c, и d.
В случае, когда последовательности нуклеотидов ДНК-мишени со-
87
держат сайты для REI, например между фрагментами a и b, частичный гидролиз дает возможность получить фрагменты a + b и
a + b + c, которые содержат непрерывающуюся нуклеотидную последовательность фрагментов a + b. Таким образом, набор фрагментов,
получаемых при неполном гидролизе эндонуклеазой REI исследуемой
ДНК, дает возможность получить всю последовательность нуклеотидов, представленную такими фрагментами: a + b, a + b + c, b+c + d,
c + d, b + c и c + d. Полученные таким образом фрагменты ДНК-
мишени для создания геномной библиотеки клонируют в векторах на
основе фага λ (рис. 49), так как последние могут обеспечить клонирование фрагментов ДНК до 20 т. п. н. и эффективность трансформации
клеток-реципиентов выше, чем у плазмидных векторов приблизительно в 1000 раз (см. раздел «Генетические векторы для клонирования ДНК»).
Рис. 49. Схема создания геномной библиотеки
с помощью вектора на основе ДНК λ-фага
Следующий после создания библиотеки этап — поиск клона
(клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода:
– гибридизацию с меченым ДНК-зондом (см. раздел «Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК») с последующей визуализацией отобранных образцов (изотопная и неизотопная) (рис. 50);
88
– иммунологический скрининг (рис. 52);
– скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью.
Рис. 50. Скрининг клонов трансформированных клеток E. coli
с помощью гибридизации
Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации
Клетки E.coli после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных
клеток. Клетки из каждой выросшей колонии переносят на твердую
подложку (например, нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр)
так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке, затем лизируют и высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и
фиксируют на фильтре. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд
и проводят детекцию, чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие
искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают
из соответствующих клонов клетки и культивируют для выделения
рекомбинантной ДНК.
Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами:
– методом концевого мечения с помощью полинуклеотидкиназы,
осуществляющей присоединение dNTP, в котором в 9-положении по
отношению к 5’-углероду дезоксирибозы встроен изотоп фосфора 32Р;
89
– методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы I;
– методом случайных праймеров, который основан на примене-
нии смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров) в виде затравки для ДНК-полимеразы I (рис. 51). Они представляют собой набор гексануклеотидов, содержащий все возможные комбинации из
четырех dNTP.
Рис. 51. Схема получения меченых ДНК-зондов
с помощью метода случайных праймеров
При использовании методов ник-трансляции и случайных праймеров в суммарный пул dNTP, так называемых «холодных», то есть
без метки, вводят один нуклеозидтрифосфот, чаще всего dATP, у которого из трех атомов фосфора — тот, который находится в α-положении по отношении к 5’-углероду дезоксирибозы, представлен изотопом 32Р или 33Р. При встраивании такого меченого субстрата в
синтезируемую полинуклеотидную цепь, то есть при образовании новой фосфодиэфирной связи, отщепляется пиррофосфат — атомы
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]