Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
колонии. Это связано с тем, что обычно при встраивании в полилинкер
чужеродной ДНК не может образовываться полноценный продукт гена
lacZ', и, следовательно, в процессе α-комплементации не образуется активная ß-галактозидаза, расщепляющая субстрат X-Gal до продукта, который и обеспечивает окрашивание клеток колоний в синий цвет.
Векторы на основе бактериофага λ
Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК,
размеры которых не превышают 10 т. п. н. Однако для решения задачи клонирования хромосомной ДНК даже небольшого организма, например бактерии, необходимо создавать полные коллекции фрагментов этой ДНК, поэтому часто приходится работать с более крупными
фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Ε. coli.
При проникновении фага λ в клетки E.coli существуют два альтернативных пути развития событий.
I. Литический цикл — фаг начинает активно размножаться, и
примерно через 20 минут клетка разрушается с высвобождением до
100 новых фаговых частиц.
II. Состояние лизогении — фаговая ДНК включается в хромо-
сому E.coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными клетками. Однако при неблагоприятных условиях (нехватка питания) запускается литический цикл (рис. 23):
1. При репликации кольцевой ДНК бактериофага λ образуется
линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной
примерно 50 т. п. н. Каждый из этих сегментов представляет собой
полноразмерную фаговую ДНК, фланкированную липкими cosсайтами — одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их
называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом подобно липким концам рестрикционных фрагментов.
2. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке
присоединяется уже собранный отросток.
Размер ДНК фага λ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения
фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим
возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет
реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага, «встав-
51
шего» на литический путь развития. Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы (рис. 24).
Рис. 23. Литический путь развития бактериофага λ:
1 — упаковка в головку фага одного сегмента полноразмерной фаговой ДНК;
2 — сборка полноценной фаговой частицы
52
Рис. 24. Использование векторов на основе фага λ
для клонирование фрагментов ДГК в клетках Ε. сoli
Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro
ДНК фага λ проводят с помощью двух штаммов E.coli, каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ (рис. 25). Один из мутантов не способен синтезировать белок А
(один из полипептидов фаговой терминазы), другой — белок Е (белок
головки фага). Оба этих белка необходимы для упаковки ДНК фага λ.
«А»- и «Е»-экстракты смешивают и добавляют конкатемерную (сегменты полноразмерной фаговой ДНК, полимеризованные по cos-сайтам)
ДНК фага, которая связывается с терминазой прежде, чем происходит
разрезание в cos-сайтах, и упаковывается в фаговые головки.
Рис. 25. Упаковка in vitro ДНК фага λ
При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается
неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более
52 т. п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку.
Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.
Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным
фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реци-
53
пиенты основан на естественном природном явлении — трансдукции
фаговой ДНК.
Трансдукция (лат. transduction — перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую
бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клеток-реципиентов или какого-либо
специального приборного оснащения.
Для поиска клеток, содержащих фаги с рекомбинантными ДНК,
используют методы молекулярной гибридизации и иммунологический скрининг, которые рассмотрим ниже.
Гибридные векторы
Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15–25 т. п. н., что недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35–40 т. п. н. Требуемой
емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами.
Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in
vitro введены cos-сайты ДНК фага λ. Отсюда происходит название
всего типа данных векторов (cosmid).
Космиды — один из видов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага λ. Такие
векторы могут включать до 40 т. п. н. чужеродной ДНК (рис. 26).
Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым
условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает,
что последовательность нуклеотидов λ-ДНК, расположенная между
двумя cos-сайтами и заключающая в себе весь фаговый геном (35–
45 т. п. н.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине
фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая
искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности
бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится
фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30–40 т. п. н. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее
поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то что
54
емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев
105–106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК.
Рис. 26. Схема, демонстрирующая принцип конструирования
рекомбинантных ДНК на основе космидного вектора
Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется
лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой
инфекции.
В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако
сходство является более глубоким в случае векторов, называемых
фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК,
которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом
бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же
упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.
Векторные системы
для клонирования очень крупных фрагментов ДНК
Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки
(> 100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например,
55
при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов.
Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до
300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор
на основе бактериофага Р1. Природная форма бактериофага Р1 Е. coli
в виде профага не интегрирует в хромосому, а существует в плазмид-
ной форме. Фактически ДНК фага Р1 представляет собой природную
фазмиду. Вектор РАС — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1 (Р1-artificial chromosomes).
В 1992 году Хируоко Шизуя создал также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 350 т. п. н.,
на основе F-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. coli,
которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой lacZ' векторов pUC. Эта конструкция называется бактериальной искусственной хромосомой (ВАС, англ. bacterial artificial
chromosomes) (рис. 27).
Рис. 27. Клонирование фрагментов ДНК большого размера с помощью ВАС
56
Манипуляции процедуры клонирования фрагментов ДНК в клетках E.coli с использованием ВАС-вектора осуществляется в такой же
последовательности, как было рассмотрено в случаях с применением
плазмидных векторов pBR322 и pUC19 (рис. 20, 22). Особо следует
отметить, что трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе ВАС проводится методом электропорации.
Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC — yest artificial
chromosome). Эта система предназначена для клонирования очень
больших фрагментов ДНК (до 2000 т. п. н.), которые потом поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы (рис. 28).
YAC-система очень стабильна.
Рис. 28. YAC-система клонирования
YAC-плазмида (pYAC) содержит селективный маркерный ген
E. coli (Ampr); сайт инициации репликации, функционирующий в
E. coli (oriE); сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки URA3,
CEN, TRP1 и ARS (CEN — последовательность, выполняюшая цен-
57
тромерную функцию, ARS — дрожжевая автономно реплицирующаяся последовательность, эквивалентная дрожжевому сайту инициации
репликации, URA3 — один из генов биосинтеза урацила, TRP1 —
один из генов биосинтеза триптофана). Т — это теломерные области
дрожжевой хромосомы, SmaI — сайт, по которому осуществляется
клонирование.
pYAC сначала обрабатывают SmaI, ВатHI и щелочной фосфатазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК длиной от 100 до
2000 т. п. н. Конечная генетическая конструкция содержит клонированную ДНК и может стабильно поддерживаться в дрожжевых клетках Ura-Trp-.
Способы трансформации дрожжевых клеток
1. Экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные
стенки которых удалены химически или энзиматически (сферопласты).
2. Клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают
ацетатом лития.
3. Электропорация.
YАС-вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит
последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность),
сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и
действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы. При встраивании чужеродной ДНК в YAC может происходить
нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток
на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YAC-векторы несут селективный маркер, независимый
от сайта клонирования.
58
ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ТЕХНОЛОГИИ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК
Химический синтез ДНК
В настоящее время достаточно быстро можно синтезировать искусственные фрагменты нуклеиновых кислот разной длины и любого
состава (такие фрагменты называются олигонуклеотидами), а затем
соединить их в более длинные цепи с помощью специальных ферментов. Полученные таким образом гены и их фрагменты широко используются в генетической инженерии, биотехнологии, а также для
диагностики инфекционных и генетических заболеваний. Так, химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать:
– для конструирования целых генов или их фрагментов;
– для амплификации специфических фрагментов ДНК;
– для направленных мутаций изолированных ДНК;
– в качестве зондов при гибридизации;
– в качестве линкеров, облегчающих клонирование.
Напомним, что нуклеиновые кислоты являются нерегулярными
биополимерами, состоящими из мономерных структур — нуклеотидов (рис. 29).
Таким образом: нуклеотид = нуклеозид + фосфорная кислота =
азотистое основание+ пентоза+фосфорная кислота.
В РНК пентоза — рибоза, в ДНК — дезоксирибоза.
В состав нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов входят пять
нуклеотидов, отличающихся между собой строением азотистого гетероцикла. Три из них — производные аденина (А), гуанина (G) и цитозина (С) — входят в состав и ДНК и РНК, производное тимина (Т) —
только в ДНК, урацила (U) — только в РНК. Нуклеотиды в отличие от
нуклеозидов содержат остаток фосфорной кислоты. Нуклеотиды соединяются друг с другом в полимерную цепочку с помощью фосфо-
59
диэфирных связей (рис. 30). Азотистые основания не принимают участия в соединении нуклеотидов одной цепи.
Рис. 29. Состав и строение нуклеотида
Рис. 30. Схема соединения нуклеотидов
с помощью фосфодиэфирной связи
Задачей химического синтеза нуклеиновых кислот является соединение входящих в их состав мономеров в строго определенной последовательности. Для образования межнуклеотидной связи должно
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]