Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
Вставки ДНК
При конструировании рекомбинантных ДНК используют три источника ДНК-вставок:
1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью физиче-
ских методов, например, с помощью обработки ультразвуком либо с
помощью эндонуклеаз рестрикции;
2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или
ферментативным методоми либо при комбинировании этих методов;
3) фрагменты ДНК (кДНК), полученные с помощь обратной
транскрипции in vitro.
При гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции часто образуются фрагменты, которые без дополнительной модификации можно использовать в виде вставки при создании рекомбинантной молекулы
ДНК. В других случаях концы фрагментов ДНК, которые будут использованы как вставки, подвергают различным модификациям с помощью ферментов-инструментов.
Вставки геномной ДНК. Под геномной ДНК подразумевается
совокупность всех последовательностей ДНК данного организма,
обеспечивающая полное воспроизведение его в потомстве. В клетках
эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре
клетки в составе хромосом (ядерная или хромосомная ДНК), а также в
некоторых клеточных органоидах — митохондриях и пластидах (митохондриальная и хлоропластная ДНК). В клетках прокариотических
организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула
ДНК прикреплена изнутри к клеточной мембране. У прокариот, как и
у низших эукариот (например, дрожжей), встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые, молекулы ДНК, называемые плазмидами. Кроме того, одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов.
Метод получения фрагментов ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции отличается высокой воспроизводимостью. Специфические
ферменты разрезают данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. При получении необходимого для работы фрагмента,
находящегося в пуле продуктов рестрикции, необходимо провести
обогащение смеси нужным фрагментом ДНК. С помощью методов
электрофореза в полужидкой среде, а также жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой можно получить
41
значительное обогащение смеси требуемым фрагментом ДНК. Следующим этапом является идентификация специфических фрагмен-
тов, которые часто называют ДНК-мишень или ДНК интереса.
Векторы для клонирования ДНК
В основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна включать в себя новые последовательности ДНК,
обеспечивать их перенос в системы, где созданная in vitro ДНК будет
воспроизводиться in vivo, давая начало новому клону клеток, отличному фенотипически от исходных клеток хозяина (реципиента). Исходя из этого, вектор, в данном случае генетический, представляет
собой молекулу ДНК, которая должна соответствовать определенным
требованиям.
1. Способность к автономной репликации, то есть обладание ori
(точка инициации репликации). Другими словами, генетический век-
тор должен содержать последовательности нуклеотидов, обеспечивающие не только его собственную репликацию, но и воспроизведение встроенной в него вставки чужеродной ДНК.
2. Наличие в структуре вектора хотя бы одного уникального, то
есть встречающегося на молекуле ДНК только один раз, сайта для какой-либо эндонуклеазы рестрикции, по которому происходит встраивание вставки ДНК.
3. Наличие в структуре ДНК вектора селективного маркера —
гена или генов, кодирующих белки, которые отсутствуют в клетках
реципиента, например белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам. Это обеспечивает возможность вести отбор клонов, содержащих вектор со встроенной вставкой ДНК.
4. Небольшой размер ДНК вектора.
5. Обеспечение достаточной копийности в клетке-хозяине.
Рассмотрим подробно группу векторов, которые носят название
плазмидные, поскольку созданы на базе природных генетических
элементов бактерий и удовлетворят практически всем требованиям,
предъявляемым к генетическим векторам. Рассмотренные выше подходы манипулирования ДНК прежде всего применялись для создания
удобных и надежных плазмидных векторов.
42
Плазмидные векторы
Плазмиды — это внехромосомные, встречающиеся в природе
кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные к автономной
репликации внутри бактериальных клеток.
Природные плазмиды содержат в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), а также
гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Продукты экспрессии плазмидных генов благодаря высокой копийности плазмид
обеспечивают клетке синтез большого количества ферментов, которые инактивируют антибиотики или ксенобиотики, что и обеспечивает устойчивость (резистентность) к последним.
Благодаря небольшому размеру плазмидную ДНК довольно легко
выделить в чистом виде. Плазмидные ДНК легко «поглощаются» бактериальными клетками, если их обработать ионами кальция. Попавшие в клетку-хозяин молекулы ДНК плазмид реплицируются, образуя
множество себе подобных копий. Однако бактериальная клетка
обычно может содержать в своем составе плазмиды только одного
типа. Это явление называется «несовместимость плазмид».
Число копий плазмиды в клетке может существенно варьироваться и зависит как от генетических особенности бактерии-хозяина,
так и от самой плазмиды. Плазмиды, находящиеся «под ослабленным
контролем» со стороны хромосомной ДНК хозяина, могут быть представлены в клетке от 10 до 200 копиями. Если же плазмида находится
«под строгим контролем», она реплицируется с той же скоростью, что
и главная хромосома, следовательно, содержится в клетке в одной
или нескольких копиях. Однако такие малокопийные плазмидные
ДНК также используют для создания векторов. Дело в том, что под
действием антибиотика хлорамфеникола прекращается репликация
хромосомной ДНК и клетка не делится, но плазмидная ДНК в таких
условиях реплицируется и получается увеличение числа копии этой
ДНК.
Плазмидный вектор pBR322
При работе с клетками E. coli чаще всего используют плазмид-
ный вектор pBR322. Этот вектор был сконструирован Боливаром и
Родригесом в 80-е годы прошлого века с помощью классических ге-
43
нетических методов (in vivo) и методов, применяемых при работе с
рекомбинантными ДНК (in vitro). Наименование вектора, как и наименования всех векторов на основе плазмид, содержит латинскую
букву «p» от aнглийского слова «plasmid». Заглавные буквы «B» и
«R» обозначают первые буквы фамилий создавших вектор исследователей: Bolivar и Rodriguez, а число 322 — цифровое обозначение,
взятое из их исследовательских протоколов. pBR322 имеет многие
свойства идеального плазмидного вектора для клонирования ДНК
(рис. 18).
Рис. 18. Плазмидный вектор pBR322
Показаны уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции;
участки ДНК, обеспечивающие устойчивость к ампициллину (ampr) и
тетрациклину (tetr), а также участок инициации репликации (ori).
Установлена полная нуклеотидная последовательность этого вектора длиной 4361п.н. Наличие в ее структуре участка инициации репликации (ori) от природной плазмиды кишечной палочки colE1 обеспечивает репликацию исключительно в E.coli и дает возможность
получить плазмидную ДНК с высоким выходом (10–20 копий на
клетку). Нуклеотидные последовательности pBR322 содержат уникальные участки узнавания для эндонуклеаз рестрикции, что дает
возможность получения линейных молекул плазмиды с разнообразными липкими концами. Кроме того, этот вектор содержит два селективных маркера: гены устойчивости к ампициллину (ampr) и тетрациклину (tetr).
44
Клетки E.coli, содержащие pBR322, выращивают на питательных
средах c ампициллином или тетрациклином либо с обоими антибиотиками. Если встроить какой-либо фрагмент ДНК по рестрикционному сайту, расположенному в одном из маркерных генов, то этот ген
инактивируется (рис. 19).
Рис. 19. Фенотипические свойства клеток,
содержащих плазмиду pBR322 со вставками и без них
Так, при встраивании ДНК, например по сайту для эндонуклеазы
рестрикции PstI, расположенному на участке, кодирующем устойчивость к ампициллину, не может синтезироваться белок, обеспечивающий рост клеток, содержащих такую рекомбинантную ДНК, на
средах с ампициллином. Такие клетки способны расти на средах, содержащих тетрациклин, но не ампициллин. И наоборот, вставки сегментов ДНК по участкам узнавания ферментов, расположенных в гене
устойчивости к тетрациклину, например HindIII или BamHI, оставляют возможность выживания клеток только на средах с ампициллином.
При любой локализации вставки в молекуле вектора происходит отбор только тех бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмидные ДНК.
45
Введение рекомбинантной ДНК в клетки бактерий и отбор
трансформантов
Процесс введения рекомбинантной ДНК в бактериальную клетку
называется трансформацией. Результатом трансформации является
приобретение клеткой-хозяином новых последовательностей ДНК и,
следовательно, новых фенотипических признаков, например устойчивости к определенным антибиотикам. Клетка-хозяин, используемая в
таких экспериментах, должна иметь определенный фенотип, в частности r
–
, то есть в ней не должно быть ферментов рестрикции; она
должна быть неспособна к общей рекомбинации (recA–), чтобы экзогенная ДНК не модифицировалась в результате гомологичной рекомбинации. Одна из самых широко используемых для этих целей культур — лабораторный штамм бактерий E.coli — штамм К12.
Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются
компетентными. Компетентность E. coli необходимо индуцировать, а
некоторые другие бактерии обладают этим свойством изначально.
Долю компетентных клеток можно повысить, используя специальную
питательную среду или условия культивирования. Для бактерий, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы
доставки ДНК.
Самыми часто применяемыми в лабораторной практике приемами трансформации бактериальных клеток являются:
– трансформация E.coli с помощью обработки хлоридом кальция;
– электропорация — увеличение проницаемости клеток под воз-
действием импульса тока длительностью ~4,5 мс.
Результаты трансформации можно оценивать количественно, определяя либо частоту, либо эффективность трансформации.
Частота трансформации — доля клеток в клеточной популяции, получивших чужеродную ДНК; выражается числом трансформантов к общему числу клеток.
Эффективность трансформации — число трансформантов в
расчете на 1 мкг ДНК, взятой для трансформации.
Информация по клонированию рекомбинантных ДНК с помощью
плазмидного вектора pBR322, изложенная в данном разделе, суммирована в виде схемы эксперимента и представлена на рисунке 20.
1. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в уча-
стке, определяющем устойчивость к ампициллину.
46
Рис. 20. Клонирование ДНК в плазмидном векторе pBR322:
1, 2, 3, 4 и 5 — этапы процедуры клонирования (см. текст)
2. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI
и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с
помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет
обеспечить им выживание на среде с ампициллином.
3. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК.
4. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформа-
ции высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей
антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, то есть
отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК
pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, то есть восстановилась первоначальная структура вектора.
5. Индивидуальные колонии клеток E.coli, выросшие на чашке с
тетрациклином, пересевают на чашки две чашки, одна из которых со-
47
держит агар с ампициллином, а вторая — с тетрациклином. Клетки,
содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на
агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость
к ампициллину, у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК, в то время как клетки с исходной, то есть восстановленной,
векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, то есть в
исходном состоянии.
Из клеток отобранных клонов E.coli экстрагируют плазмидную
ДНК и анализируют ее структуру.
Другие плазмидные векторы
Эпоха вектора pBR322, начатая Боливаром и Родригесом в 80-х годах ХХ столетия, продолжается и по сей день. Однако, при всей своей
надежности и классическом соответствии всем необходимым для векторов требованиям этот вектор имеет всего несколько удобных сайтов
для клонирования. Кроме того, отбор трансформированных клеток в
экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени. Возникла необходимость разработки альтернативных, более совершенных систем клонирования. Так была создана группа векторов семейства pUC. В названии векторов этого семейства буквы
«U» и «C» — это первые буквы от слов University of California. Ис-
следователями этого университета была создана серия векторов,
имеющих важную черту — наличие в структуре ДНК встроенного
синтетического полилинкера, который представляет собой последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора — MCS (Mul-
tiple Cloning Sites). Названия индивидуальных векторов из семейства
pUC отличаются двузначным числом, а первичная структура разных
векторов отличается составом сайтов MCS MCS — Multiple Cloning
Sites в полилинкере.
Рассмотрим подробнее особенности векторов, входящих в эту
группу, на примере вектора pUC19 (рис. 21).
Плазмида pUC19 имеет длину 2686 п. н. и содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы
(lacZ') лактозного оперона E.coli; ген lacI, кодирующий репрессор,
который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер — короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания
для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХmаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI,
48
HinсII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации
плазмиды ColE1.
Рис. 21. Плазмидный вектор pUC19
(объяснение к карте дано в тексте)
Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие
данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком. Такие модульные элементы структуры рассматриваемого вектора, как lacZ', lacI и MCS, дают возможность ускорить и интенсифицировать процедуру селекции клонов с
рекомбинантными ДНК.
Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду
pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lacI, так называемый репрессор, не сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ', и, как следствие, будут
происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена
lacZ'. Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация), и в результате образуется актив-
ная ß-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на
продукцию функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид
(X-Gal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с
образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную, то есть без вставки чужеродной ДНК, плазмиду pUC19 (рис. 22).
49
Рис. 22. Последовательность процедур клонирования ДНК в векторе pUC19.
1, 2, 3 и 4 — этапы клонирования (см. текст)
1. Донорную ДНК обрабатывают одной из эндонуклеаз рестрик-
ции, для которой имеется сайт в полилинкере. Векторную ДНК
pUC19 обрабатывают тем же ферментом
2. Лигирование линеаризованного вектора и вставки с помощью
ДНК-лигазы Т4.
3. После процедуры лигирования инкубационной смесью прово-
дят трансформацию клеток, способных к α-комплементации, которые
могут синтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ' с образованием активного фермента.
4. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампи-
циллином, ИПТГ и субстратом для ß-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином
колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную, то есть
рекомбинантную, плазмиду, образуют на той же самой среде белые
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]