Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
фосфора в γ- и β-положениях, а 32Р остается встроенным в сахарофосфатную цепь.
Нерадиоактивные системы детекции используют ферментативное
превращение хромогенного или хемолюминисцентного субстрата:
первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй —
испускает свет.
Последовательности нуклеотидов, которые могут служить ДНКзондами для скрининга геномной библиотеки, можно получить, по
крайней мере, двумя способами: использовать клонированную ДНК
близкородственного организма (гетерологичный зонд) либо получить
методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.
Иммунологический скрининг
Если клонированный ген экспрессируется, то его продукт — весь
белок или часть — можно обнаружить иммунологическими методами
(рис. 52).
Рис. 52. Скрининг клонов трансформированных клеток E.coli
с помощью специфических антител:
1–6 — этапы эксперимента (описание см. в тексте)
91
1. Клетки из каждой выросшей колонии переносят на твердую
подложку.
2. Осуществляют лизис клеток и клеточные белки фиксируют на
фильтре.
3. Фильтр помещают в раствор, содержащий первые антитела
(АТ), которые специфично связываются (преципитируют) только с
искомым белком.
4. Несвязавшиеся первые АТ удаляют, наносят на фильтр вторые
АТ, специфичные в отношении первых, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой).
5. Отмывают фильтр от несвязавшихся вторых АТ и помещают в
раствор, содержащий субстрат для фермента, при гидролизе которого
образуется окрашенный продукт. Гидролиз может произойти только в
присутствии вторых антител, к которым присоединен фермент. Таким
образом, окрашенные пятна на фильтре будут соответствовать колониям клеток, в которых происходит синтез специфичного белка, то
есть клеткам-трансформантам.
6. Отбирают колонии на чашке, соответствующие окрашенным
пятнам на фильтре, и культивируют их. В них может содержаться рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, гомологичный первым АТ.
Скрининг по активности белка
Метод гибридизации ДНК и иммунологические методы позволяют идентифицировать многие гены и их продукты. Если при этом искомый ген кодирует фермент, не синтезируемый клеткой-хозяином,
то для обнаружения клонов, содержащих данный ген, можно использовать метод идентификации на чашках, основанный на выявлении
активности белка — продукта детектируемого гена. Для этого клоны
Е. соli, составляющие геномную библиотеку изучаемых организмов,
высевают на чашках с питательной средой, содержащей специфический субстрат. После окрашивания селективным красителем клетки,
способные утилизировать этот субстрат, приобретали специфическую
окраску.
Если искомый ген кодирует продукт, без которого мутантная
клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку
можно создать методом трансформации мутантных клеток. Клетки,
выросшие при отсутствии необходимого субстрата на минимальной
среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмидного вектора.
92
Клонирование структурных генов эукариот
Структура генов прокариот очень проста: есть начало, есть конец,
получается мРНК, которая имеет начало и конец, идет транскрипция,
трансляция и белок (рис. 53, А). Даже если при фрагментировании геномной ДНК последовательность нуклеотидов, кодирующих структуру определенного белка, прерывается, метод частичного гидролиза
позволяет получить рекомбинантные ДНК, в сумме представляющие
собой полноразмерный структурный ген интересующего исследователя белка.
Структура гена эукариот сложнее (рис. 53, Б). Из длинной премРНК (первичный транскрипт) удаляются (вырезаются) интроны
(insertion sequences, вставочные последовательности), а оставшиеся
экзоны сшиваются в единую нить. Из пре-мРНК в результате процесса, который получил название сплайсинг, получается зрелая мРНК.
Потом происходит трансляция зрелой мРНК, в результате образуется
белок.
Рис. 53. Схема основных этапов экспрессии генов
в клетках прокариот (А) и эукариот (Б)
Проблемы клонирования эукариотических генов в системе прокариот включает два основных момента.
1. Прокариоты не способны удалять интроны из первичных
РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических
мРНК в бактериальной клетке невозможна.
93
2. Экспрессия эукариотической ДНК может осуществляться
только при наличии эукариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию (кэп, поли-А-хвост
и др.)
В связи с этим для клонирования генов эукариот разработаны и
применяются другие схемы. Можно выделить основные этапы таких
экспериментальных подходов:
– выделение мРНК на колонках, заполненных олиго(dT)-целлюлозой или олиго(dT)-сефарозой;
– cинтез одноцепочечной кДНК на матрице мРНК с помощью
ревертазы, праймера олиго(dT) и четырех dNTP;
– cинтез двухцепочечной кДНК;
– после завершения синтеза молекулы мРНК гидролизуют РНК-
азой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой SI, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек;
– кДНК встраивают в плазмидный вектор и получают кДНКбиблиотеку.
Для скрининга кДНК-библиотеки также можно использовать метод гибридизации или иммунологические методы.
94
СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ
Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид
Основная цель экспериментов по клонированию генов в составе
рекомбинантных ДНК, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Для этой цели в биотехнологии используют
специализированные векторы — экспрессионные (рис. 54) и соответствующие клетки-реципиенты.
Рис. 54. Основные функциональные модули
экспрессионного вектора для прокариот
Способность к экспрессии — одно из самых важных свойств
гена. За это свойство отвечают различные генетические элементы
(последовательности нуклеотидов), которые необходимо встроить в
векторную молекулу, несущую ген. Такие последовательности нуклеотидов принято называть регуляторными. Напомним, что к ним относятся последовательности, которые регулируют прочность и точность связывания с молекулой ДНК-матрицы фермента РНК-поли-
95
меразы, а также последовательности, сигнализирующие об окончании
процесса транскрипции (промотор и терминатор соответственно).
Кроме того, синтезируемая в процессе транскрипции мРНК должна
содержать в своей структуре последовательности, которые обеспечат
ее точное связывание с малой субъединицей рибосомы, тем самым
гарантируя правильную трансляцию. А это требует введения в структуру рекомбинантной ДНК участков, которые получили название сайты
связывания рибосом (rbs — ribosome bind site). Упомянутые структурные элементы ДНК обеспечивают также и достаточную копийность как мРНК, так и синтезируемых полипептидов. Также при конструировании экспрессирующихся рекомбинантных ДНК необходимо
предусмотреть место в клетке, где будет осуществляться экспрессия
вводимых последовательностей ДНК: в цитоплазме в составе плазмидной ДНК или после интеграции в хромосомную ДНК хозяина.
Кроме того, в структуре рекомбинантной ДНК должна содержаться
информация и о месте локализации в клетке синтезируемого конечного продукта, то есть белка. Однако понятие системы экспрессии
включает в себя не только структурные модули экспрессирующихся
рекомбинантных ДНК, но и особенные характеристики клеток-хозяев,
где планируется осуществлять экспрессию. В данном разделе будут
рассмотрены некоторые общие моменты, которые необходимо учитывать при выборе системы экспрессии.
Следует отметить, что никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. В то же время
можно выделить наиболее важные свойства систем экспрессии:
1. Тип промотора и терминатора транскрипции.
2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.
3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плаз-
миде или в хромосоме хозяйской клетки).
4. Конечная локализация синтезируемого продукта.
5. Эффективность трансляции в организме хозяина.
6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.
В исследовательской работе, а также для производства важных в
коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E. coli. Это связано с тем, что генетические, молекулярно-
биологические, биохимические и физиологические свойства этого
микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.
96
При рассмотрении генетических векторов для клонирования ДНК
(см. раздел «Генетические векторы для клонирования ДНК») мы по-
знакомились с семейством векторов pUC, в состав которых входят
некоторые модули системы α-комплементации лактозного оперона
E. coli. Данные регуляторные элементы транскрипции Lac-оперона
дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе,
обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.
В системе E. coli для экспрессии клонируемых генов наиболее
широко используются следующие регулируемые промоторы: lac- и
trp-оперонов E. coli; специально сконструированный tac-промотор,
включающий -10- область lac-промотора и -35-область trp-промотора;
левый, или pL, промотор бактериофага λ, а также промотор гена 10
бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие
репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.
При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов
расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. Как правило, многокопийные плазмиды требуют
больше энергии, чем малоколийные, и в результате часть клеток в
процессе роста популяции клеток утрачивает плазмиды. Лишившиеся
своих плазмид клетки обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились. В конечном счете такие клетки оказываются в культуре
преобладающими, что через какое-то число генераций отражается на
количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Чтобы избежать этой проблемы, в лабораторных условиях для сохранения
плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть
плазмида. Это приводит к значительному удорожанию конечного
продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены не только сохранялись в культивируемых клетках, но и не передавались другим
микроорганизмам. Ген должен не только оставаться эффективным, но
и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в
хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без
экспрессии в составе плазмид и избежать утраты интересующих исследователя генов.
97
Экспрессия генов,
интегрированных в хромосомную ДНК прокариот
При встраивании гена-мишени в хромосомную ДНК хозяина необходимо, чтобы сайт интеграции не находился внутри гена, кодирующего важную клеточную функцию хозяина. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный сайт хозяйской ДНК.
Кроме того, для обеспечения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в
хромосомной ДНК хозяина, в пределах которых и должен произойти физический обмен (рекомбинация) между двумя молекулами
ДНК (рис. 55).
Рис. 55. Схема одного из механизмов интеграции
генетического материала в хромосому
Ген встроен в середину клонированного в плазмиде участка ab,
гомологичного участку a'b' в хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера (Χ–Х) клонированный ген оказывается в составе
хромосомы.
Процесс интеграции состоит в следующем.
1. Идентификация подходящего сайта интеграции, то есть участка хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки.
98
2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интегра-
ции или его части в составе плазмидной ДНК.
3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором
в клонированный сайт интеграции или вблизи него.
4. Перенос полученной генетической конструкции «хромосомный
сайт интеграции/клонированный ген» в хозяйскую клетку в составе
плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого
хозяина.
5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, в которые одним из
способов детекции (см. раздел «Библиотека генов») выявляется экспрессия гена-интереса. Наследование клонированного гена возможно
только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.
Экспрессия рекомбинантных генов
в эукариотических системах
При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках
часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения.
Это связано с отсутствием в клетках прокариот систем, обеспечивающих посттрансляциюнные модификации эукариотических белков, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток:
– образование дисульфидных связей (неправильно уложенный
белок может оказаться нестабильным и неактивным);
– протеолитическое расщепление предшественника, удаление
определенного участка полипептидной цепи с образованием функционального белка;
– гликозилирование: основная модификация, благодаря которой
белки приобретают стабильность или особые свойства;
– модификация аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование и др.
Все эти модификации структуры белка, а также правильное сворачивание белковой молекулы (фолдинг), которое в клетках эукариотов осуществляют шапероны, влияют на его растворимость, стабильность и биологические функции. Поскольку в бактериальных клетках
соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков
99
отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает
ограничения на использование бактерий в биотехнологии. Поэтому
используют системы эукариотических клеток: дрожжей, насекомых,
животных и растений, в геном которых рекомбинантные гены вводятся с помощью трансфекции.
Выбранную эукариотическую систему экспрессии проверяет на
наличие всех необходимых условий для требующейся в каждом конкретном случае посттрансляционной модификации и фолдинга продукта вводимого рекомбинантного гена.
Эукариотические экспрессирующие векторы, как и их прокариотические аналоги, должны содержать в структуре следующие функциональные модули (рис. 56):
– эукариотический селективный маркер;
– эукариотический промотор;
– соответствующие эукариотические сайты терминации транс-
крипции и трансляции;
– сигнал полиаденилирования мРНК.
Рис. 56. Обобщенная структура
эукариотического экспрессирующего вектора
эукариотический транскриптон с промотором (Р), множественным сайтом
клонирования (МСК) и сигналами терминации и полиаденилирования (Т);
эукариотический селективный маркер (СМ
функционирующий в клетках эукариот (ori
функционирующий в E. coli (oriЕ); селективный маркер E. coli (Аmрг)
euk
); сайт инициации репликации,
euk
); сайт инициации репликации,
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]