Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Часть 1. Технология рекомбинантной ДНК. Учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов)
.pdf
2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибри-
да РНК — ДНК;
3) ДНК-эндонуклеазной активностью.
Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а
эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в
геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах (рис. 11).
Рис. 11. Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК
Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в
процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. В генетической инженерии используют как
олиго-(дТ) праймеры, комплементарные 3'-полиА концам мРНК, так и
набор «случайных» по составу и последовательности гексануклеотидов
(random primers). Часто для молекул РНК с известной первичной после-
довательностью, не имеющих З'-поли (А) концов, используют химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные 3'-концу.
31
Обратную транскриптазу преимущественно используют для
транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных
условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых
молекул РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и
разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.
Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход
полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза
первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей
шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю
расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности
последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью
фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы,
размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для
дальнейших исследований.
Терминальная трансфераза, поли-А-полимераза
Терминальная трансфераза (терминальная дезоксинуклеотидил
трансфераза) катализирует присоединение мононуклеотидов к 3'-OH
концу ДНК-затравки, в процессе присоединения мононуклеотида отщепляется пирофосфат. Одноцепочечная ДНК служит наиболее эффективной затравкой.
Терминальная трансфераза является в определенном смысле полимеразой, поскольку она катализирует синтез полидезоксирибонуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с высвобождением
неорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам она требует присутствия праймера со свободной 3’-гидроксильной группой.
Однако ей не нужна матрица, она вообще не способна копировать
что-либо вообще, и продуктом катализируемой ею реакции является
одноцепочечный полимер (рис. 12).
32
Рис. 12. Реакция, катализируемая
терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой.
N — любой из четырех дезоксинуклеотидов: A, T, G или С
Терминальная трансфераза в присутствии в качестве кофактора
ионов Mg
2+
использует в качестве затравки одноцепочечную ДНК с 3'ОН концом или двухцепочечную ДНК с выступающим одноцепочечным 3'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются ионы
Co2+, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.
При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы
ДНК, имеющие гомополимерные 3'-концы. Таким же образом можно
достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при
определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК. Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 году был выполнен первый эксперимент по
рекомбинации молекул ДНК in vitro.
С помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к молекуле ДНК,
не имеющей липких концов, можно присоединять такие концы.
Подобно терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазе поли(А)-
полимераза присоединяет нуклеотидные остатки к 3’-ОН концу одно-
цепочечных молекул без матрицы. Однако поли(А)-полимераза проявляет специфичность, осуществляя независимое от матрицы последовательное присоединение остатков аденилата к 3'-OH-концам
молекул РНК в соответствии со следующей реакцией:
РНК + nATP → РНК(А)n + nPPi.
Поли(А)-полимераза выполняет высокоспециализированную и
важную функцию в экспериментах с рекомбинантными ДНК: подготовка РНК к копированию с них комплементарной ДНК. Кроме того,
ее применяют для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК.
33
СПОСОБЫ ОБЪЕДИНЕНИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК
Создание рекомбинантной ДНК — это процесс объединения in
vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных
биологических источников. Фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности структурных или регуляторных участков
генов, представляющих интерес для исследователя, получают с использованием эндонуклеаз рестрикции. Эти ферменты, как было рассмотрено в предыдущей главе, могут образовывать фрагменты ДНК
как с тупыми, так и с липкими концами. В зависимости от цели, для
которой создается новая ДНК, а также от наличия в арсенале исследователя ферментов для модификации ДНК объединение различных
фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.
Лигирование по одноименным липким концам
Данный метод является самым распространенным и популярным.
Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с
сотрудниками в 1973 году. Одноцепочечные концы, получаемые при
гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции, например EcoRI, образуют водородные связи с комплементарными им последовательностями другого конца этого же фрагмента или другого фрагмента ДНК.
Таким образом, любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же эндонуклеазы
рестрикции, могут слипаться за счет образования водородных связей
между комплементарными основаниями нуклеотидов однонитевых
концевых участков (рис. 13).
Однако образование водородных связей между комплементарными основаниями одноцепочечных участков ДНК не восстанавливает полной целостности двойной спирали, поскольку остаются два разрыва в сахарнофосфатном остове полинуклеотидной цепи. Для
34
восстановления фосфодиэфирных связей в полинуклеотидных цепях
ДНК, то есть для сшивания, или лигирования, нитей используют фермент ДНК-лигазу.
Рис. 13. Схема объединения фрагментов ДНК по липким и тупым концам
(рестрикционно-лигазный метод)
Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию — сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.
Лигирование по одноименным липким концам
с обработкой щелочной фосфатазой
При лигировании двух фрагментов ДНК, один из которых является линеаризованным вектором (см. раздел «Генетические векторы
для клонирования ДНК»), а другой — донорной ДНК, содержащей
нужный фрагмент ДНК и предварительно обработанной такой же эндонуклеазой, как и вектор, целесообразно применить еще один фермент-инструмент: щелочную фосфатазу. Чтобы предупредить комплементарное взаимодействие между липкими концами одного и того
же типа рестрицированных фрагментов, например линеаризованного
вектора, проводят обработку фосфатазой, которая отщепляет фосфат-
35
ные группы на 5’-концах одноцепочечных липких концов. ДНКлигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной векторной ДНК (рис. 14).
Рис. 14. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор
Плазмидную ДНК, обработанную эндонуклеазой рестрикции и
щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной
ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из
четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям.
Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя
в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с
помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной
ДНК и рестрицированной донорной ДНК (рис. 14). При репликации
этой ДНК после введения ее в клетку-реципиент одноцепочечные
разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.
36
Лигирование по тупым концам
Тупые концы также можно соединять с помощью ДНК-лигазы,
если и фермент, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в
высоких концентрациях (рис. 13). В этом случае реакция лигирования
имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по
липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в
1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США.
Липкие концы можно присоединить к фрагментам ДНК с тупыми
концами ферментативным путем. Для этого используют фермент терминальную трансферазу из тимуса теленка, который присоединяет
нуклеотиды к 3’-концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при объединении полученных таким образом фрагментов происходит комплементарное
спаривание за счет образования водородных связей между олиго
(dА)- и олигo (dT)-последовательностями (рис. 15). Для ковалентного
соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК, который получил название коннекторный
метод.
Рис. 15. Создание липких концов и сшивка фрагментов ДНК
коннекторным методом
37
Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании
ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод. При таком способе
соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие
дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции
соединяемых молекул, и поэтому всегда, когда только возможно, для
получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия эндонуклеаз рестрикции.
Лигирование фрагментов
с разноименными липкими или липким и тупым концами
В ситуациях, когда необходимо сшить фрагменты ДНК, образованные разными эндонуклеазами рестрикции и имеющими разные,
то есть некомплементарные друг другу липкие концы, или тупой и
липкий концы, применяют адаптеры (to adapt — переделывать) или
линкеры (to link — связывать). Это молекулярные «переходники».
Адаптер представляет собой синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким (рис. 16). После
пришивания адаптера тупым концом к фрагменту ДНК на конце последнего появляется липкий конец для сшивания с комплементарным
ему концом другого фрагмента. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.
Синтезированы большие наборы таких генных «переходников».
Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться
необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, нуклеотидные последовательности промотора или последовательности, соответствующие участку
связания с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обусловливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец — липкий конец», «липкий — липкий» и
«липкий — тупой» (рис. 16).
При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это
достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента —
эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», то есть с помощью ДНК-полимеразы I
на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить (рис. 17).
38
Рис. 16. Изменение концов фрагментов ДНК
с помощью различных адаптеров:
тупой — липкий (1); липкий — липкий (2); липкий — тупой (3)
Рис. 17. Преобразование липких концов
рестрикционных фрагментов ДНК в тупые
Линкеры, содержащие участки узнавания для нескольких эндонуклеаз рестрикции, называются полилинкерами, или множественными сайтами клонирования (MCS — multiply cloning sites). Они будут
рассмотрены в следующей главе.
39
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ДНК
Когда рассматривается вопрос создания функциональной рекомбинантной ДНК, необходимо иметь в виду, что он касается не только
конструирования с помощью биологических инструментов ДНК с новыми, заданными последовательностями нуклеотидов. Из системы in
vitro, в которой полинуклеотиды с помощью ферментов образуют заданные новые последовательности, нужно осуществить переход in vi-
vo, то есть нужно перейти в живую систему, которая с помощью своих ферментных систем обеспечит основные генетические процессы:
репликацию, транскрипцию и трансляцию. Матрицей для них будет
созданная рекомбинантная ДНК. Таким образом, технология рекомбинантной ДНК подразумевает также систему «хозяин — рекомбинантная ДНК». Окружающий нас живой мир многообразен, но управляющие им биологические законы универсальны. Именно это
позволяет нам применять их для достижения собственных целей с
помощью биотехнологии.
При создании рекомбинантной ДНК исследователь может преследовать разные цели. Первая, которая часто является и конечной
целью, — это наработка в достаточных количествах небольших фрагментов ДНК, необходимых для детального исследования всей исследуемой ДНК, например полное секвенирование генома. Такая процедура называется клонированием, то есть создается клон клеток,
который содержит в составе рекомбинантной ДНК строго определенный участок изучаемой ДНК. Если же целью является изучение продуктов экспрессии каких-либо нуклеотидных последовательностей, то
простого клонирования ДНК недостаточно. В этом случае конструируемая ДНК должна содержать определенные регуляторные последовательности, которые способны обеспечивать экспрессию последовательностей нуклеотидов в виде соответствующих мРНК, а затем и
полипептидов.
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]