Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Руководство к проведению лабораторных работ по нормальной физиологии
.pdf
камеры. Кнаружи от желобов, образующих букву «Н», находятся две
прямоугольные пластинки, к которым притирается шлифованное
покровное стекло. Сетка Горяева (Рис. 3) состоит из 225 больших
квадратов, 25 из которых разделены поперечными и продольными
полосами на 16 малых. Сторона малого квадрата составляет 1/20 мм,
2
площадь – 1/400 мм
камеры над малым квадратом равен 1/4000 мм
, глубина камеры – 1/10 мм, следовательно, объем
3
.
Перед заполнением камеры ее и покровное стекло промывают водой,
протирают ватным тампоном, смоченным эфиром или спиртом, а затем
сухой полотняной салфеткой. Затем притирают покровное стекло к
боковым поверхностям камеры скользящими и давящими движениями
больших пальцев обеих рук до появления радужных (ньютоновых) колец.
Перед заполнением камеры выпускают на ватный тампон две-три капли
содержимого из капилляра, затем заполняют камеру, нанося каплю
разведенной крови на среднюю пластину у края покровного стекла. В силу
капиллярности жидкость равномерно распределится над сеткой. После
заполнения камеру оставляют на одну минуту для равномерного
распределения и оседания эритроцитов.
Рис.1. Смесители для подсчёта эритроцитов и лейкоцитов.
3. Подсчет эритроцитов
Камеру кладут на предметный столик микроскопа, установленный
горизонтально, и приступают к подсчету эритроцитов при малом
9
увеличении микроскопа (объектив 8х, окуляр 10х или 15х). Поле зрения
должно быть затемнено диафрагмой и несколько опущенным
конденсором. Подсчитывают эритроциты в 5 больших квадратах,
разделенных на 16 малых (всего в 5×16=80 малых квадратах),
расположенных по диагонали. Во избежание двукратного подсчета клеток,
лежащих на границе квадратов, руководствуются правилом Егорова:
считают эритроциты, находящиеся внутри квадрата и на его верхней и
левой границах.
Рис.2. Общий вид счетной камеры.
Результаты подсчета фиксируют, определяют суммарное количество
эритроцитов, найденных в 80 малых квадратах, и рассчитывают
количество клеток в 1 мкл крови по формуле: Х = А•4000•200/80, где
Х – искомое число эритроцитов в 1 мкл;
А – число эритроцитов в 80 малых квадратах;
3
1/4000мм
– объем разведенной крови над одним малым квадратом;
80 – число малых квадратов;
200 – степень разведения.
6
Полученное число умножают на 10
и получают содержание клеток в
1 л крови.
Ошибка метода составляет ±2-3%.
Возможные источники ошибок при подсчете эритроцитов
1.Образование сгустка во время взятия и разведения крови.
2.Несоблюдение условий, обеспечивающих должную высоту камеры
(неправильный выбор покровного стекла и плохое его притирание к
камере).
3.Проведение подсчета сразу после заполнения камеры, когда клетки
еще не распределились равномерно и не осели.
4.Попадание воздуха в капилляр с кровью.
10
большой квадрат
малый квадрат
Рис. 3. Фрагмент сетки Горяева.
В протокол вносится изображение сетки Горяева с обозначением
большого и малого квадратов, указывается количество эритроцитов в
больших квадратах, а также приводятся формула расчета и полученный
результат. В заключении сравнивают результаты подсчета с
физиологической нормой. При значительном отклонении полученного
результата от физиологической нормы следует исключить ошибки
проведения работы.
Работа 2. Определение количества лейкоцитов
Цель работы: знакомство с классическим методом определения
количества лейкоцитов в периферической крови.
Для работы необходимы: исследуемая кровь, меланжер для
лейкоцитов, камера с сеткой Горяева, микроскоп, 3%-ный раствор
уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим, спирт, вата, груша.
Ход работы
Взятие и разведение крови осуществляют с помощью смесителя для
лейкоцитов. Смеситель имеет меньший объем ампулы по сравнению со
смесителем для эритроцитов и содержит белую бусинку. Набирают кровь
до метки «0,5», затем уксусную кислоту - до метки «11», чем достигают
разведения в 20 раз. Для разрушения оболочки эритроцитов и
11
прокрашивания ядер лейкоцитов после перемешивания содержимого ждут
5 минут.
Заполнение камеры проводят так же, как описано в работе 1. Подсчет
лейкоцитов осуществляют в 100 больших квадратах, что соответствует
100×16=1600 малым. Количество лейкоцитов в 1 мкл крови вычисляют по
формуле: Х=А•4000•20/1600, где
А – найденное количество лейкоцитов в 100 больших квадратах;
20 – степень разведения крови;
3
1/4000 мм
– объем разведенной крови над малым квадратом;
1600 – количество малых квадратов.
Для определения числа лейкоцитов в 1 л крови полученный
6
результат умножают на 10
.
Ошибка метода составляет в среднем ±7%.
Источники ошибок при подсчете лейкоцитов в счетной камере те же,
что и при подсчете эритроцитов. Кроме того, в число лейкоцитов могут
войти и эритробласты, если они имеются в крови. Их наличие у
испытуемого выясняют при изучении морфологии клеток в
фиксированных и окрашенных препаратах.
В протокол вносят найденное число лейкоцитов, фрагмент сетки
Горяева с указанием квадратов, в которых считают лейкоциты, формулу
определения количества лейкоцитов в крови и полученный результат.
В заключении сравнивают результат с физиологической нормой и
анализируют возможные причины несоответствия результатов нормативу.
Работа 3. Определение количества гемоглобина в крови по методу
Сали
Цель работы: знакомство с классическим методом определения
количества гемоглобина.
Для работы необходимы: исследуемая кровь, гемометр Сали, 0,1N
раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, спирт, вата, груша.
Метод основан на колориметрическом принципе. При смешивании
крови с соляной кислотой гемоглобин превращается в солянокислый
гематин, имеющий коричневый цвет. Полученную смесь разводят
дистиллированной водой до цвета раствора в стандартных пробирках,
находящихся в крайних гнездах гемометра (Рис. 4). Этот раствор имеет
интенсивность окраски, соответствующую содержанию гемоглобина,
равному 166,7 г/л.
Ход работы
1. В градуированную пробирку гемометра наливают до первой метки
(2г%) 0,1%N раствор соляной кислоты.
3
2. Капиллярной пипеткой набирают кровь точно до метки 20 мм
и
осторожно выдувают ее на дно пробирки. Не вынимая пипетку из
12
пробирки, промывают ее соляной кислотой. Встряхивая пробирку,
тщательно перемешивают ее содержимое. Для завершения реакции смеси
дают постоять не менее пяти минут.
Рис. 4. Гемометр Сали
3. Специальной пипеткой прибавляют к смеси по каплям
дистиллированную воду, перемешивая содержимое палочкой. Это
продолжают до тех пор, пока цвет исследуемой жидкости не сравняется с
окраской стандартного раствора.
4. Отмечают по шкале, на каком делении стоит уровень верхнего
края мениска полученного раствора солянокислого гематина. Чтобы
выразить результат в системе СИ (г/л), умножают найденную цифру на 10.
Источниками ошибок могут быть:
а) выцветшие стандартные растворы в старых гемометрах;
б) неточное соблюдение пятиминутной выдержки перед началом
разведения (гематиновая окраска со временем усиливается);
в) попадание воздуха в капилляр с кровью.
В заключении следует указать, соответствует ли норме найденное
количество гемоглобина.
Работа 4. Вычисление цветового показателя
Цель работы: научиться рассчитывать цветовой показатель крови.
Величина 33,4 пг, представляющая собой условное нормальное
содержание гемоглобина в одном эритроците, принимается за единицу и
обозначается цветовым показателем (ЦП). На величине цветового
показателя основана клиническая классификация анемий: при
13
гипохромной анемии ЦП ниже 0,85, при нормохромной ЦП=0,85-1,05, при
гиперхромной ЦП больше 1,05.
Цветовой показатель рассчитывают по формуле: ЦП = Гф/Гн :
Эф/Эн, где
Гф – найденное (фактическое) количество гемоглобина в г/л;
Гн – условное нормальное количество гемоглобина в крови человека
– 166,7 г/л;
Эф – найденное (фактическое) количество эритроцитов;
12
Эн – условное нормальное количество эритроцитов (5·10
/л).
В протокол необходимо записать формулу и результаты расчета ЦП.
В заключении следует указать на степень соответствия полученных
результатов нормальным величинам.
Работа 5. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по
методу Панченкова
Цель работы: знакомство с методикой определения СОЭ.
Для работы необходимы: исследуемая кровь, прибор Панченкова,
часовое стекло, 5%-ный раствор лимоннокислого натрия, спирт, вата.
Ход работы
1.Промывают капилляр Панченкова 5%-ным раствором
лимоннокислого натрия. Набирают в пробирку раствор до метки «50» (Р) и
выдувают его на часовое стекло.
2. Дважды набирают в капилляр кровь до метки «0» (К). Кровь
выдувают на часовое стекло в каплю раствора лимоннокислого натрия,
каждый раз тщательно смешивая ее с раствором путем выдувания через
капилляр воздушной струи, направленной на смесь крови с цитратом.
3. Промывают капилляр раствором лимоннокислого натрия,
заполняют капилляр полученной цитратной кровью точно до метки «0» (К)
и помещают в штатив строго вертикально.
4. Через один час определяют, на сколько миллиметров осели
эритроциты, и результаты вносят в протокол.
В заключении следует указать, соответствует ли полученный
результат данным, характеризующим СОЭ здорового человека.
Работа 6. Гемолиз
Цель работы: убедиться в возможности развития осмотического и
химического гемолиза.
Для работы необходимы: исследуемая кровь, 4 пипетки емкостью 2
мл, дистиллированная вода, кислота (любая), 0,9%-ный раствор хлористого
натрия, 0,3%-ный раствор хлористого натрия, спирт, вата.
14
Ход работы
4 пробирки ставят в штатив, нумеруют и наливают в них:
1) 2 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия;
2) 2 мл дистиллированной воды;
3) 2 мл 0,3%-ного раствора хлористого натрия;
4) 2 мл кислоты.
Добавляют в каждую пробирку по две капли крови и смешивают
содержимое; результат читают через 30 минут. При наличии гемолиза над
осевшими эритроцитами появляется розовое окрашивание.
В заключении следует сделать выводы об отсутствии или наличии
гемолиза и объяснить его механизмы в разных пробирках.
Работа 7. Определение групповой принадлежности крови по системе
АВО
Цель работы: знакомство с методикой определения групповой
принадлежности крови по системе АВО.
Для работы необходимы: исследуемая кровь, стандартные
сыворотки всех групп двух разных серий, изотонический раствор
хлористого натрия, предметные стекла, пипетки, стеклянные палочки,
карандаши для записи по стеклу, спирт, вата.
Ход работы
Определение группы крови производят при температуре 15-20
◦
С.
1. На чистые предметные стекла в обозначенные участки наносят по
капле сыворотки Ι, IΙ, IΙI групп двух серий (всего шесть капель).
2. В каждую каплю сыворотки с помощью стеклянных палочек или
разных углов чистых предметных стекол вносят небольшое количество
крови и размешивают. Соотношение объемов крови и сыворотки должно
составлять примерно 1:10.
3. Покачивают стекла в течение пяти минут.
4. По мере наступления агглютинации, но не раньше, чем через три
минуты, в каждую смесь добавляют по капле изотонического раствора
хлористого натрия для предупреждения образования «монетных
столбиков» из эритроцитов.
5. Определяют наличие агглютинации в каждой капле. При
отсутствии агглютинации во всех каплях кровь относят к Ι группе. При
отсутствии агглютинации в сыворотке IΙ группы и наличии ее в
сыворотках I и ΙII групп кровь относят ко ΙI группе. При отсутствии
агглютинации в сыворотке IΙI группы и наличии ее в сыворотках I и II
групп кровь относится к III группе. При наличии агглютинации во всех
сыворотках кровь можно отнести к IV группе. В этом случае для
исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых
эритроцитов необходимо провести дополнительное исследование со
стандартной сывороткой труппы АВ (IV). Отсутствие агглютинации в этой
15
капле позволит считать реакцию специфической и отнести исследуемую
кровь к IV группе.
Возможные ошибки при проведении работы
1. Оценка реакции как отрицательной при фактическом наличии
агглютинации. Это может быть обусловлено:
а) поздней или слабо выраженной агглютинацией в связи с малой
активностью стандартных сывороток;
б) нарушением соотношения 1:10 при взятии большого количества
крови;
◦
в) наличием температуры воздуха, большей, чем 25
С, в таких
условиях исследование проводят при охлаждении стекла.
2. Оценка реакции как положительной при фактическом отсутствии
специфической агглютинации. Это может быть обусловлено:
а) образованием «монетных столбиков»;
б) наличием панагглютинации, которая развивается при температуре
◦
15
С; для ее исключения следует повторить определение при более
высокой температуре;
в) подсыханием сыворотки и образованием по краям капель
«зернистости», принимаемой за агглютинацию; это может быть в
случаях, когда чтение результатов производят более, чем через пять
минут.
В заключении в протокол следует записать, к какой группе относится
исследуемая кровь, и тщательно обосновать полученный результат. Для
этого необходимо последовательно сделать выводы об отсутствии или
наличии агглютиногенов А и В в исследуемой крови по развитию или
отсутствию агглютинации в каждой капле сыворотки, а затем подвести
общий итог и сделать заключение о группе исследуемой крови, исходя из
её антигенного состава. Следует указать, в каких случаях исследуемая
кровь может быть использована в качестве донорской.
Рекомендуемая дополнительная литература
1. Атлас по нормальной физиологии: Пособие для студентов медицинских
и биологических спецециальностей вузов / Под ред. Н.А.Агаджаняна. –
М.: Высшая школа, 1987.
2. Воробьев А.И. Руководство по гематологии в 3-х томах. – М., 2003.
3. Гольдберг Е.Д. и др. Динамическая теория кроветворения. //
Бюлл.эксп.биол.мед. 1999. № 5. С. 484-494.
4. Физиологические системы организма человека, основные показатели
(справочное пособие) / Под ред. Г.И. Козинца – Триада-Х, 2000.
5. Физиология человека. Под ред. Р.Шмидта, Г.Тевса. – В 3-х томах.
Издание 2-е. – М.: Мир, 1996. Том II, Гл. 18.
6. Фундаментальная и клиническая физиология. Перев. с англ. и нем. Под
ред. А.Камкина и А.Каменского. М.: Академия, 2004. Гл IХ.
7. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. // Рос. физиол. журн.
2000. № 3. С. 252-267.
16
ГЛАВА III
ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. ПИТАНИЕ. ТЕРМОРЕГУЛЯЦИЯ
Вопросы
1. Обмен веществ – основная форма движения материи и необходимое
условие жизни. Диалектическое единство процессов ассимиляции и
диссимиляции в организме. Закон сохранения энергии в живых
организмах.
2. Основные этапы обмена веществ и энергии.
3. Общий (валовый) обмен и составляющие его компоненты. Рабочий
обмен.
4. Основной обмен, его величина и факторы, ее определяющие.
5. Понятие о специфически динамическом действии пищевых веществ, его
роль в саморегуляции массы тела.
6. Методы определения величины расхода энергии в организме: прямая и
непрямая физиологическая калориметрия.
7. Дыхательный коэффициент как показатель углеводного и жирового
обмена. Калорический эквивалент кислорода.
8. Калорическая ценность пищевых веществ; определение количества
энергии, поступившей в организм.
9. Баланс прихода и расхода веществ; азотистый баланс. Понятие о
белковом оптимуме и минимуме.
10. Регуляция обменных процессов в организме.
11. Физиологические принципы адекватного питания. Значение для орга-
низма белков, жиров, углеводов, витаминов, минеральных компонентов
пищи. Закон изодинамии, его ограниченность.
12. Температура тела человека, её суточные колебания. Понятие об
оболочке, ядре тела и их терморегуляторных различиях.
13. Физиологические механизмы теплопродукции и теплоотдачи, их
значение для жизнедеятельности теплокровных животных.
14. Функциональная система изотермии. Нервные и гуморальные
механизмы терморегуляции.
15. Адаптация к холоду как путь повышения специфической и
неспецифической резистентности организма.
Вопросы для фармацевтического факультета
1. Понятие об обмене веществ и энергии. Единство ассимиляции и
диссимиляции.
2. Общий (валовый) обмен веществ, его составляющие. Понятие об
основном обмене.
3. Методы определения расхода энергии: прямая и непрямая
калориметрия.
17
4. Значение белков, жиров, углеводов: их калорическая и биологическая
ценность.
5. Основы адекватного питания. Принципы составления пищевых
рационов.
6. Понятие о гомойотермии. Температура тела человека, ее суточные
колебания.
7. Понятие об оболочке и ядре тела и их терморегуляторных различиях.
8. Физиологические механизмы теплопродукции.
9. Физиологические механизмы теплоотдачи, их значение для
жизнедеятельности теплокровных животных.
10. Нервные и гуморальные механизмы терморегуляции.
ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ
Работа 1. Определение энергорасхода методом непрямой
калориметрии по спирограмме
Цель работы: ознакомление с методом непрямой калориметрии.
Для работы необходимы спирограммы.
Объем поглощенного кислорода определяют по подъему основания
спирограммы. Одному сантиметру высоты подъема соответствует
количество поглощенного кислорода, равное 0,2 л.
Расчет времени проводят, зная, что скорость движения бумаги
составляет 50 мм/мин.
Ход работы
1. Находят по спирограмме количество потребленного за 1 мин.
кислорода в литрах. Приводят этот объем к нормальным условиям (Т =
0°С, Р – 760 мм рт. ст.), для этого пользуются номограммой (рис. 5).
Предварительно необходимо иметь сведения о температуре и
барометрическом давлении в момент исследования.
2. Дыхательный коэффициент условно приравнивают величине 0,84,
характерной для смешанного питания.
3. Находят калорический эквивалент кислорода (КЭК), для этого
пользуются таблицей 1.
18
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]