Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis. Монография
.pdf
увеличению либо к уменьшению числа микросателлитных звеньев,
способствуют либо образованию неканонических структур либо сохранению
линейной структуры в случае однонитевой молекулы ДНК. Исследование
вторичных структур возможно лишь при расчетах энергий образования
ДНК/ДНК-дуплексов в сочетании с математическими и информационными
инструментами компьютерных систем. Компьютерное моделирование
вторичных структур исследуемых в данной работе локусов пока
зывает, что
способность образовывать неканонические вторичные структуры зависит от
числа мономерных звеньев в микросателлитном кластере, от типа
микросателлитного кластера и единичных нуклеотидных замен в
микросателлитных звеньях. Так, например, все аллельные варианты
обнаруженные в популяциях D. unisexualis по локусу Du214 имеют линейную
структуру, однако только при числе мономерных звеньев от 2 до 10
моделирование показывает, что нук
леотидная последовательность образует
вторичную структуру – «шпильку», размер которой зависит от количества
звеньев (см. рисунок 41). При числе звеньев превосходящих 10
востанавливается линейная структура этого локуса.
На примере локуса Du183 отчетливо наблюдается совокупное влияние
всего микросателлита на возможность локуса образовывать различные
вторичные структуры. Так, вне зависимости от протяженности
динуклеотидных и мононуклеотидных кластеров, тринуклеотидный кластер
образует вторичную ст
руктуру, показанную на рисунке 42.А. Подобная
структура сохраняется и в случае отсутствия тринуклеотидного кластера (см.
рисунок 42.Б). Однако, если бы данный локус вообще не содержал
микросателлита, то образуемая им вторичная структура имела бы совсем
другой вид (см. рисунок 42.В).
71
ок 41 – Вторичные структуры однонитевой последовательности ДНК
Рисун
локуса Du214. А – с микросателлитом (GT)
при n=10. Цифрами показаны порядковые номера некоторых
(GT)
n
при n=2, Б – с микросателлитом
n
нуклеотидов в последовательности.
Влияние всего одного микросателлитного звена и всего одной
нуклеотидной замены произошедшей в нем хорошо иллюстрируется на
примере (GATA)
-микросателлитных локусах. Например, в случае локуса
n
Du281 линейная структура молекулы сохраняется при количестве
микросателлитных звеньев равном двум или превосходящим два мономера.
Однако, при полном отсутствии микросателлита нуклеотидная
последовательность принимает вид, показанный на рисунке 43.А, а при
появлении первого же микросателлитного звена, с произошедшей в нем
нуклеотидной заменой гуанина на цитозин, количество «шпи
лек» и их размер
заметно уменьшается (см. рисунок 43.Б).
72
Ри
сунок 42 – Вторичные структуры однонитевой последовательности
ДНК локуса Du183. А – НП наблюдаемая в природе, Б – НП без
тринуклеотидного кластера, В – НП без микросателлита. Цифрами показаны
порядковые номера некоторых нуклеотидов в последовательности.
Значимость количества мономерных звеньев и типа микросателлитных
кластеров наглядно демонстрируется на примере локуса Du255. Так, расчеты
показывают, что при любом количестве (GT)-мономеров сохр
аняется
линейность молекулы. Такая же ситуация наблюдается и при появлении АТ-
кластера. Однако, так только число АТ-звеньев достигает и начинает
превосходить n=9, то нуклеотидная последовательность данного участка
локуса Du255 образует шпильку, показанную на рисунке 44, которая
увеличивается в соответствии с увеличением АТ-кластера.
73
ок 43 – Вторичные структуры однонитевой последовательности
Рисун
ДНК локуса Du281. А – НП без микросателлита, Б – НП с САТА мономерным
звеном. Цифрами показаны порядковые номера некоторых нуклеотидов в
последовательности.
Рисун
ок 44 – Вторичная структура однонитевой последовательности
ДНК локуса Du255 с числом (АТ)
мономерных звеньев n=9. Цифрами
n
показаны порядковые номера некоторых нуклеотидов в последовательности.
74
Имеются данные, свидетельствующие о полярности мутаций внутри
микросателлитных ДНК [Sturzeneker et al., 1998] и повышенной частоте
однонуклеотидных замен во фланкирующих микросателлит областях ДНК
[Colson et al., 1999]. При этом частота мутаций в них может превышать
частоту мутаций микросателлитного кластера, что показано на примере
динуклеотидных микросателлитов беспозвоночных [Orti et al., 1997].
Сравнивая данные о структуре аллельных вариантов, которые были
показаны на тетрануклеотидных микросателлитных локусах Du2
15, Du323,
Du281 [Kogchagin et al., 2007] у D. unisexualis и в популяциях других
партеногенетических видов - D. armeniaca для локуса Du215 [Малышева с
соавт., 2007] и D. dahli для локуса Du323 [Вергун с соавт., 2007] можно
сказать, что наблюдаемые различия между аллелями этих локусов
выражались в вариациях размеров микросателлитного кластера на одно или
более мономерное звено (что соответствует одноступенчатой классической
модели) и единичным точковым заменам (га
плотипам) в прилежащих к
микросателлиту областях. В случае локусов Du215 и Du281, а также Du323
показано, что гаплотипы происходят от двуполых родоначальных форм
[Kogchagin et al., 2007]. В данной работе нами обнаружены устойчивые
фиксированные двойные нуклеотидные замены - G-T (аллели 1, 3, 5 и 6) и A-
A (аллели 2 и 4), происходящие в динуклеотидном локусе Du214,
соответственно от «материнского» вида – D. raddei и «отцовского» вида D.
valentini, однак
о в отличии от тетрануклеотидных локусов точковые мутации
в Du214 локализовались непосредственно в самом микросателлитном
кластере.
Изучение нуклеотидного состава микросателлитных локусов
представляется важным потому, что существует отчетливая взаимосвязь
между первичной структурой молекулы ДНК, структурной организацией
генома и функциональной компартментализацией интерфазных ядер [Medini
et al., 2005], которая особенно ярко проявляется в термодинамической
классификации участков генома на та
к называемые семейства изохор.
75
Изучение нуклеотидного состава локусов показывает, что локусы
Du183, Du214, Du231, Du255, Du365, Du215, Du281 и Du323 стабильны по
GC-составу вне зависимости от размера рассматриваемого участка локуса и
отклонения по GC-составу для любого рассматриваемого аллельного
варианта незначительны (см. таблицы 6 и 7). С учетом этого факта, можно
предположить, что GC-содержание для этих локусов может сохраняться на
протяжении 100-300 тыс. нуклеотидов. В таком случа
е локусы Du183, Du231,
Du255 и Du365 можно отнести к первому семейству «тяжелых» изохор, для
которых характерна локализация в теломерных зонах метафазных хромосом и
ранняя репликация в клеточном цикле [Medini et al., 2005], а локусы Du214,
Du215, Du323 и Du281 - к семейству «легких» изохор, имеющих иную
локализацию и поздно реплицирующихся.
3.3. Сравнительный анализ, практика и перспективы применения
предложенной математической модели
Для ана
лиза полученного аллельного разнообразия нами в данной
работе была предложена система уравнений, составляющая единую
математическую модель. При реализации данной математической модели
были получены результаты, характеризующие генетический вклад каждой
популяции по каждому аллельному варианту с учетом распределения частот
аллелей локуса Du214 имеющихся в данной популяции и расчетом
совокупного генетического вклада по каждой популяции в генофонд ви
да.
Следует отметить, что в настоящее время все существующие
математические модели, использующие данные молекулярной генетики и
молекулярной биологии нуклеиновых кислот для популяционных
исследований можно подразделить на детерминистические и стохастические.
Детерминистическая модель характеризуется четко и однозначно
определенными значениями переменными и параметрами, при которых
76
предыдущее во времени значение функции (начальный баланс) четко
Н
определяет будущее значение функции [Хедрик, 2003].
Стохастическая модель характеризуется тем, что переменные и
параметры принимают значения с некоторой вероятностью. При этом нет
четкой и однозначной зависимости будущего значения функции от
предыдущего. Для определения вероятности таких событий иногда
пользуются распределением вероятностей. Если модель сложная, для
вычисления прибегают к компьютерным базам данных на основе случайных
чисел и методу Монте-Карло.
В настоящее время в арсенале математической биологии для описания
генетического разнообразия существует ряд математических показателей,
которые позволяют оценить уровень меж- и внутрипопуляционного
разнообразия [Ризниченко, 2002]. К таким показателям относятся:
гетерозиготность, или внутрипопуляционное разнообразие, и
межпопуляционное разнообразие генофонда. Подобные параметры наиболее
часто применяются в генетико-популяционных исследованиях и в том числе в
исследованиях ящериц рода Darevskia. Однако, в работе [Петросян с соавт.,
2003] показано, что оценка генетического разнообразия по классической
формуле Нея:
A
j
1
2
n
2
)1(
xh
j
, (15)
12
n
STF
где: n – количество особей, A – количество аллелей на локус,
j-го аллеля конкретного локуса, некорректна в условиях исследования
партеногенетических видов животных, т.к. она, как и все остальные
перечисленные показатели, применимые в математических моделях биологии
и построенные на основе учета аллельного разнообразия, основываются на
математических следствиях из закона Харди-Вайнберга. В основе данного
закона лежат такие определяющие допущения (ограничения)
случайно скрещивающихся особей и большое генетическое разнообразие
77
x частота
i
как: наличие
популяций, образующее пул (общий фонд) генов – которые однозначно не
имеют место в популяциях партеновидов в принципе [Хедрик, 2003].
Именно поэтому и выражение генетического разнообразия,
адаптированное для L-локусов:
A
2
x
k
2
1
H
k
L
где: А - общее количество выявляемых аллелей мономорфных и
полиморфных локусов,
аллеля, полученное на основе преобразования формулы Нея:
L
i
Н
11
x частота k-го аллеля конкретного локуса, k - номер
k
A
j
2
n
2
)1(
x
ij
n
L
A
2
x
k
2
1
k
L
где: А
, - количество аллелей i-го локуса, xij - наблюдаемая частота для i-
i
го локуса j-го аллеля, не может быть эффективно применено в исследованиях
партеногенетических популяций.
Поэтому в работе [Петросян с соавт., 2003] предложена другая формула
для расчета приближенного значения генного разнообразия, которое
определяется на основе частот рестрикционных фрагментов s
применения ДНК-фингерпринтного анализа с использованием
микросателлитных маркеров:
k
H
n
)1(
A
s
k
1
L
, (17)
12
n
2
2
n
)1(
12
n
n
)1(
12
, (18)
, (16)
12
n
2
n
12
n
L
iAj
11
ii
2
x
ij
)1(
L
в результате
k
78
Так как данная модель рассчитана на технологию ДНК-фингерпринта,
то очень интересным представляется вопрос определения общего количества
локусов. В целом это является не простой задачей, поскольку в
фингерпринтном профиле для полиморфных локусов невозможно определить
совокупность аллельных вариантов для каждого локуса. Ранее использовали
выражение:
)4(SSm
L
где: m - среднее значение рестрикционных фрагментов на особь, S -
среднее значение внутрипопуляционного индекса сходства.
Однако, в исследованиях партеногенетических видов рода Darevskia
наиболее приемлемым оказалось выражение:
которое, с учетом дисперсии (Var) количества локусов:
дает следующее выражение для расчета приближенного значения
генного разнообразия партеновидов:
H
Следует отметить, что в отношении популяций партеновидов в целом и
популяций рода Darevskia в частности этот принцип расчета и его
модификации для ДНК-фингерпринтного анализа наиболее распространены.
При этом нет системы расчета результатов монолокусного ПЦР-анализа для
, (19)
)2(4
A
sL
k
, (20)
1
i
A
sVarLVar
)()(
k
A
1
k
A
1
k
k
2
s
k
2
n
)1(
12
n
s
k
A
1
N
2
k
, (22)
ss
)1(
kk
11
, (21)
79
партеновидов, целью которой была бы количественная оценка
популяционной структуры генофонда.
Из всего вышеописанного следует, что в настоящей работе впервые
представлена детерминистическая модель, служащая для количественной
оценки вклада популяций в генофонд партеногенетического вида,
работающая на основе данных монолокусного ПЦР-анализа и допускающая,
на основании ограничений №1 и №2 (см. гл.3), одновременный расчет по
р
езультатам ПЦР-анализа нескольких полиморфных локусов.
Помимо количественной оценки вклада популяций в генофонд вида, эти
данные позволяют сформулировать следующий вывод: сумма частот
различных аллельных вариантов в каждой конкретной популяции
фиксированно-гетерозиготного партеновида является величиной постоянной
и равной между популяциями этого партеновида, вне зависимости от
соотношения частот аллелей этого локуса внутри ка
в целом, т.е.:
21
Докажем это утверждение в общем виде в рамках предложенной нами
математической модели для любого фиксированно-гетерозиготного
партеновида, предварительно указав, что под фиксированной
гетерозиготностью понимается то, что все особи вида являются
одновременно только либо гаплоидными, либо диплоидными, либо
тетраплоидными и т.д. по данному локусу, т.е.:
FFF
j
ждой популяции и в виде
.
ljZjconstSSS
...3,2,1,0|...
0| Zcconstc
, где:
плоидность особей.
c –
Из условия фиксированной гетерозиготности следует, что:
k
1
i
Отсюда:
cnm
jij
, (23)
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]