Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis. Монография
.pdf
Кроме того, выявление в популяциях аллельных вариантов локуса
Du183 позволило изучить все приведенные выше молекулярно-биологические
и биохимические параметры в условиях естественного (природного)
мутационного процесса, затрагивающего данный микросателитсодержащий
локус.
ПЦР-продукты каждого аллельного варианта были клонированы и
секвенированы. Показано, что аллельные варианты локуса Du183 отличаются
лишь различиями в микросатллитном кластере, произошедшими за счет
изменений в числе микросателлитных звеньев. Структура кластеров и
молекулярно-биологическая характеристика последовательностей ДНК
аллельных вариантов Du183 обобщена в таблице 6.
31
Таблица 6 - Сравнительные биохимические и физико-химические характеристики полиморфных динуклеотидных
* - полная вставка рекомбинантного клона;
** - ПЦР-амплификант на ДНК рекомбинантного клона
Du214 GTAA(GT)
2 (TG)
3 (TG)
1 (TG)
2 GTAA(GT)
4 GTAA(GT)
6 GTAA(GT)
1 (GT)
3 (GT)
5 (GT)
Du183 (TG)
аллельный
вариант
Локус* /
микросателлитных локусов и их аллельных вариантов
** Микросателлитный кластер (
26
29
233
41,7
-1592048 -6833
25
225
227
41,5
-1534213 -6819
-1548672 -6822
41,5
24
223
41
-1519754 -6815
21
221
40,8
-1502598 -6799
21
20
219
40,8
-1488140 -6795
10
(AG)
7
(G)
7
(AGG)
558
10
201
40,9
-1411458 -7022
-3807123 -6823
50
7
7
(AG)
(AG)
7
7
(G)
(G)
7
7
(AGG)
(AGG)
10
9
192
195
47,7
48,9
-1334864 -6952
-1359869 -6974
10
(AG)
7
(G)
7
(AGG)
10
368
нукл.) G + C, %
48,8
Дж/моль
-2576670 -7002
Размер
ДНК,
ДНК/ДНК
дуплекса,
Суммарная ∆G
образования
дуплекса, Дж/моль
образования
Средняя ∆G
ДНК/ДНК
32
Подобные исследования были предприняты в настоящей работе и для
локуса Du214. Показано, что локус Du214, содержит совершенный (GT)
n
микросателлит. На рисунке 16 дан график, демонстрирующий изменение
процентной доли нуклеотидов первичной последовательности ДНК в
зависимости от размера нуклеотидной последовательности локуса Du214.
ок 16 - Процентная доля нуклеотидов для локуса Du214. Цветом
Рисун
показаны процентные доли различных нуклеотидов: зеленый – аденин, синий
– цитози
пар
н, черный – гуанин, красный – тимин. Вертикальными линиями
аллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
-
,
Видно, что увеличение микросателлита не изменяет количественного
превосходства тимина и место аденина в ряду процентных долей. Однако,
соотношение процентных долей ц
итозина и гуанина меняется, выравниваясь
посередине микросателлитного кластера на уровне 362 нт. локуса Du214 до
22,1%.
33
Влияние микросателлитного кластера на молекулярные массы 5’-3’ и
3’-5’ последовательностей ДНК локуса Du214 явно уравновешивающее.
Влияние микросателлитного кластера на молекулярную массу локуса Du214
показано на рисунке 17. Из приведенного графика следует, что
микросателлитный кластер в процессе своего увеличения до уровня 380 п.н.
выравнивает молекулярные массы прямой и обратной последовательностей,
однако от 380 п.н. и до завершения микросате
ллита разность несколько
возрастает, достигая 240 г/моль.
сунок 17 – Модуль разности молекулярных масс 5’-3’ и 3’-5’
Ри
последовательностей ДНК локуса Du214. Вертикальными линиями,
параллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
Влияние микросателитного кластера на свободную энергию образования
ДНК/ДНК-дуплекса для локуса Du214 показано на рисунке 18.
34
ок 18 – Средняя свободная энергия образования ДНК/ДНК-дуплекса
Рисун
для локуса Du214. Вертикальными линиями, параллельными оси ординат,
показана проекция микросателлитного кластера на график.
Для локуса Du214 величина ∆G
6823 Дж/моль, тогда как, под влиянием микросателлитного кластера ∆G
образования ДНК/ДНК дуплекса равна -
ср.
ср.
снижается до -6950 Дж/моль.
ПЦР-продукты каждого аллельного варианта локуса Du214 также были
секвенированы. На рисинке 19 представлены нуклеотидные
последовательности аллельных вариантов локуса Du214, а в ранее
приведенной таблице 6 показаны обобщенные физико-химические
характеристики этих аллельных вариантов.
35
Рисунок 19 – Нуклеотидные последовательности ДНК аллелей локуса Du214
партеногенетического вида D. unisexualis. (GT)
-кластеры выделены
n
прямоугольной рамкой. Фиксированные нуклеотидные вариации показаны
серым прямоугольником.
Все аллели локуса Du214 различаются по длине микросателлитного
кластера за счет различий в числе (GT)-повторов. Интервал различий
составляет от 22 до 29 мономеров. Кроме того, как видно из данных рисунка
37, аллели Du214 у D. unisexualis различаются также и точковыми мутациями
в начале микросателлитного кластера. Сочетания
таких фиксированных
точковых мутаций образуют двойные нуклеотидные замены G - T (аллели 1,
3, 5, и 6) и А - A (аллель 2 и 4), которые являются специфическими маркерами
для каждого аллеля, предположительно наследуемыми от разных двуполых
родительских видов. Для доказательства этого предположения в данной
работе была проведена ПЦР-амплификация ДНК двуполых видов D. raddei и
D. valentini. Амплификанты также в дальнейшем подверглись
секвенированию. На рисунке 20 показаны нуклеотидные последовательности
ДНК вариабельных участков этого локуса у родительских видов.
36
Рисун
ок 20 – Нуклеотидные последовательности микросателлитных
кластеров ортологичных локусов родительских видов. (GT)
-кластеры
n
выделены прямоугольной рамкой. Нуклеотидные вариации показаны серым
прямоугольником.
Видно, что аллельные варианты различаются не только длиной
микросателлитного (GT)
-кластера, но и характерными единичными
n
нуклеотидными заменами, образующими искомые фиксированные
устойчивые двойные нуклеотидные замены. Причем, G-T замена устойчиво
присутствует в последовательностях данного локуса у D. raddei, а А-А замена
– в нуклеотидн
ых последовательностях аллельных вариантов данного локуса
у D. valentini.
Исследование первичной последовательности локуса Du255 показало,
что локус Du255, содержит сложный микросателлит, состоящий из (GT)
кластера и вплотную прилегающего к нему (AT)
-кластера. В работе была
12
22
исследована первичная структура ДНК локуса Du255 у выборки
родительских видов – 10 особей D. raddei и 10 особей D. valentini.
Секвенирование нуклеотидной последовательности ортологичных локусов у
родительских видов показало, что аллельные варианты данных локусов
различаются только числом микросателлитных звеньев, причем (GT)-кластер
показывает больший уровень изменчивости, чем (АТ)-кластер. Изменения
(GT)-кластера составляли от 10 до 25 зв
еньев, а (AT)-кластера от 7 до 13. На
рисунке 21 показан график, демонстрирующий изменение процентной доли
нуклеотидов первичной последовательности ДНК в зависимости от размера
нуклеотидной последовательности локуса Du255.
-
37
унок 21 – Процентная доля нуклеотидов для локуса Du255. Цветом
Рис
показаны процентные доли различных нуклеотидов: зеленый – аденин, синий
– цитози
пар
н, черный – гуанин, красный – тимин. Вертикальными линиями
аллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
Видно, что микросателлит оказывает значительное влияние на
нуклеотидную последовательность локуса Du255. Нуклеотидная
последовательность до микросателлита имела превосходящую долю аденина,
равную 27,8% и приблизи
тельно равные доли всех остальных нуклеотидов:
цитозина – 22,8%, гуанина – 22,8% и тимина – 23,6%. Однако, после
микрасателлитных кластеров нуклеотидная последовательность локуса
Du255 претерпевает серьезные изменения – доли нуклеотидов по
возрастанию организуются следующим образом: тимин – 30,6% , аденин –
25,8%, гуанин – 24,7%, цитозин – 18,7%.
Влияние микросателлитного кластера на молекулярную массу локуса
Du255 показано на рисунке 22.
,
38
Рисунок 22 – Модуль разности молекулярных масс 5’-3’ и 3’-5’
последовательностей ДНК локуса Du255. Вертикальными линиями,
параллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
Из данного рисунка следует, что увеличение GT-кластера приводит к
увеличению разности молекулярных масс до 690 г/моль. Однако, экспансия
AT-кластера не изменяет достигнутой разности до самого конца
микросателлита.
Влияние микросателитного
кластера на свободную энергию образования
ДНК/ДНК-дуплекса для локуса Du255 показано на рисунке 23.
39
ок 23 – Средняя свободная энергия образования ДНК/ДНК-дуплекса
Рисун
для локуса Du255. Вертикальными линиями, параллельными оси ординат,
показана проекция микросателлитного кластера на график.
Увеличение GT-кластера незначительно понижает величина ∆G
ср.
образования ДНК/ДНК дуплекса до -7053 Дж/моль, а увеличение АТ-
кластера увеличивает свободную энергию для этого участка молекулы ДНК
до -6976 Дж/моль.
Локус Du231 содержит в своем составе совершенный микросателлит
(GT)
. Секвенирование нуклеотидной последовательности ортологичных
14
локусов у родительских видов показало, что они как у D. raddei так и у D.
valentini имеют сходную молекулярную структуру и, отличаясь только лишь
числом микросателлитных звеньев, проявляют гораздо больший уровень
полиморфизма, чем последовательности дочернего партеногенетического
вида. На рисунке 24 представлен график, демонстрирующий изменение
процентной доли нуклеотидов первичной последовательности ДНК в
зависи
мости от размера нуклеотидной последовательности локуса Du231.
Влияние микросателлитного кластера изменяет процентные доли
нуклеотидов в последовательности следующим образом: для аденина – с
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]