Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis. Монография
.pdf
Рисунок 39 – Частота встречаемости аллельных вариантов локуса Du214 у
партеновида D. unisexualis. Сектора диаграммы соответствующие
количественному вкладу каждого аллельного варианта показаны различными
вариантами штриховки.
Генетико-популяционная структура вида, демонстрирующая
совокупный генетический вклад каждой популяции, учитывающая
популяционный вклад по каждому аллельному варианту, показана на
рисунке 40.
На представленной диаграмме видно, что наибольший вклад в
генофонд
вида вносят популяции Лчап, Загалу и Норатус, формируя по 21,5%
генофонда по данному локусу, затем следуют популяции Такярлу и Кутчак
(18,4% и 17,1 % соответственно). Кроме того, результаты подсчета частот
различных аллельных вариантов локуса Du214 в каждой популяции
партеновида D. unisexualis показывают, что сумма частот различных
аллельных вариантов для каждой популяции D. unisexualis в генофонде вида
является постоянной и равной во всех популяциях:
F
Кутчак
F
Лчап
F
Загалу
F
Норатус
SSSSS
F
Такярлу
.
2,0
61
ок 40 - Генетико-популяционная структура партеновида D. unisexualis
Рисун
на основе анализа частоты встречаемости маркерных аллелей локуса Du214.
Сектора диаграммы соответствующие генетическому вкладу каждой
популяции в генофонд вида показаны различными вариантами штриховки.
62
3. Проблема изучения микросателлитной изменчивости в свете
геномных исследований
3.1. Полиморфизм микросателлитсодержащих локусов генома у
различных однополых и двуполых видов рода Darevskia.
Гипервариабельные мини- и микросателлиты являются наиболее
распространенной и универсальной системой молекулярных маркеров,
широко используемых в популяционной, эволюционной биологии и
геномном маркировании. В связи с этим в последнее время
партеногенетические
виды кавказских скальных ящериц, такие как D.
armeniaca, D. dahli, D. unisexualis и D. rostombekovi, особенно активно
исследовались при помощи мультилокусного фингерпринтного анализа и
монолокусного ПЦР-анализа. В подобных исследованиях были
охарактеризованы в основном тринуклеотидные и тетрануклеотидные
микросателлитные локусы. Следует особо отметить, что динуклеотидные
микросателлиты у D. unisexualis были исследованы впервые в данной работе.
Ранее с помощью мультилокусного
изучена изменчивость (TCT)
- микросателлитных и М13 минисателлитных
n
ДНК фингерпринтинга была
повторов ДНК в популяциях, семьях и тканях партеногенетических скальных
ящериц Кавказа Darevskia unisexualis [Рысков, 2003]. Было показано, что
популяционные и семейные образцы ДНК D.unisexualis (всего 75 образцов)
обладают индивидуально-специфическими ДНК-фингерпринтными
спектрами распределения (TCT)
супернестабильностью (TCT/TCC)
–фрагментов. Наряду с обнаруженной
n
-полипиримидиновых кластеров показана
n
инвариабельность и мономорфность картины популяционных и семейных
ДНК-фингерпринтных спектров по М13- минисателлитам в тех же образцах
ДНК D. unisexualis. Также был проведен ДНК-фингерпринтный анализ
популяционных и семейных образцов двух морфоформ (мутантной и
нормальной по дорзальной окраске туловища) партеногенетической ящерицы
63
Darevskia armeniaca с использованием М13 мини- и (GACA)n, (TCC)n
микросателлитных маркеров ДНК [Мартиросян, 2003].
Тетрануклеотидные микросателлитные маркеры также широко
применялись в фингерпринтном анализе популяций D. unisexualis [Токарская,
2003]. Несмотря на то, что во всех исследованных популяциях D.unisexualis
ДНК-фингерпринтные профили практически идентичны по М13-
минисателлитам (средний индекс сходства S=0.992), указанные популяции
оказались вариабельны по GATA-микросателлитам (S=0.862).
На примере партеногенетических ящериц наглядно
продемонстрировано, что ДНК-фи
нгерпринтинг является наиболее
эффективным методом мониторинга тотальных изменений генома. Однако,
следует отметить, что молекулярную природу и механизмы подобных
изменений данным методом изучить не представляется возможным.
Исследование подобных проблем лежит в области различных приемов и
методов молекулярно-биологической и биохимической характеристики
микросателлитных локусов, первым этапом которой является монолокусный
ПЦР-анализ. В этой связи п
артеногенетический вид D.unisexualis и другие
однополые и двуполые виды рода Darevskia достаточно интенсивно
исследовались главным образом путем изучения локусов и аллельных
вариантов локусов тетрануклеотидных микросателлитов [Корчагин с
соавт., 2004; Kogchagin et al., 2007].
С помощью монолокусного ПЦР-анализа, используя пары праймеров,
подобранные для локуса Du215 Darevskia unisexualis, было проведено
изучение аллельного полиморфизма ортологичного локуса в популяциях
родственного партеновида D. ar
meniaca [Малышева, 2005]. Было
установлено, что Du215 (arm) является полиморфным и в популяциях
партеновида D. armeniaca (n = 127) представлен как минимум тремя
аллельными вариантами, которые различаются размером и составом
микросателлитного кластера, а также одиночными нуклеотидными
заменами в прилежащих ДНК. Показано, что микросателлитный кластер
64
локуса Du215 (arm), в отличие от Du215, содержит не только GATA-, но и
(GАСА)-повторы, которые отсутствовали у D. unisexualis. Локус Du215 (arm)
является гетерозиготным и в популяциях партеновида D. armeniaca
представлен как минимум тремя аллельными вариантами, различающимися
по электрофоретической подвижности продуктов амплификации в интервале
200-250 нуклеотидных пар. Причем исследованные популяции отличаются
между собой по частоте встречаемости этих аллельных вариа
нтов. Интересно
отметить, что все особи из популяции Такярлу, представленной двумя
морфоформами, различающимися по окраске туловища, оказались
электрофоретически инвариантными и гетерозиготными по исследуемому
локусу. Гетерозиготными оказались и особи из так называемой Украинской
популяции (особи из локальной, изолированной популяции "Медведь-гора"
в Армении, интродуцированные в 1964 г. на Украину). Следует отметить,
что в да
нной популяции было обнаружено три аллельных варианта Du215
(arm). Три аллельных варианта этого локуса, различавшихся по
электрофоретической подвижности, были выявлены и в популяции
Алаверды. В остальных исследованных популяциях Du215 (arm) давал два
четко различавшихся по электрофоретической подвижности амплификанта
и, по-видимому, представлен только двумя аллельными вариантами.
Изучение молекулярной природы аллельного полиморфизма локуса Du
215
(arm) в популяциях D. armeniacа показало что, последовательности
аллельных вариантов Du215 (arm) партеновида D. armeniaca отличаются от
последовательности клона Du215 партеновида D. unisexualis размером и
составом микросателлитных кластеров, а также некоторыми
однонуклеотидными заменами и инверсиями в прилежащих ДНК. Анализ
нуклеотидных последовательностей аллелей Du215 (arm) показал, что их
микросателлитные кластеры имеют сложное строение. Аллели 1 и 2 Du215
(arm) содержат в своем сос
таве как (GATA)n-. так и (САСА)n-кластеры и
отличаются друг от друга на одно мономерное звено (GATA). Аллель 3 Du215
(arm) вообще не содержит (GACA)
-повторов и имеет более короткий
n
65
(GATA)n-кластер. Следует также указать на вариабельность концевых
участков микросателлитов у аллелей локуса Du215 (arm) и его ортолога
Du215. Эта вариабельность выражается в наличии или отсутствии мономера
GACA у 5'-конца и разной копийности GCAA-звена у 3'-конца
соответствующих вариантов данного локуса. Кроме того, аллели 1-3 локуса
Du215 (arm) друг от друга отличаются точковыми мутациями типа
транзиций и
трансверсий, расположенными на фиксированных расстояниях (-
19, -38 и -58 пн) от начала микросателлитного кластера. При этом точковые
мутации образуют два гаплотипа: T-G-C (аллели 1 и 2) и А-С-Т (аллель 3).
Интересно отметить, что аллели ортологичного локуса Du215 у D. unisexualis
также имеют фиксированные точковые замены, расположенные
соответственно на расстояниях -42 и -69 пн от начала микросателлитного
кластера, образуя двойные
устойчивые нуклеотидные замены А-А и T-G.
Локус-специфическая ПЦР использована также и для определения
генетического полиморфизма в трех популяциях партеногенетического вида
ящериц Darevskia dahli [Давоян c соавт., 2007]. Анализ проведен на выборке 26
особей по двум (САТА)
-содержащим локусам (Du215 и Du281). Обнаружено
n
восемь аллельных вариантов по локусу Du215 и три - по локусу Du281. Показано,
что все исследованные особи гетерозиготны по этим локусам. У 12 особей по
локусу Du215 обнаружен необычный аллельный вариант, происхождение
которого может быть связано с различными типами геномной реорганизации или
сегментной дупликации. Выявлены значительные различия по
уровню аллельного
полиморфизма между исследованными популяциями, что может объясняться
различными экологическими условиями обитания популяций, приводящими к
накоплению мутаций в некодирующей области генома. Таким образом, в
отличие от D. unisexualis у D. dahli уровень внутривидового полиморфизма
по локусу Du215 оказался гораздо выше, чем по локусу Du281: по локусу
Du215 у D. dahli удалось выявить не менее 8 аллельных
вариантов, а по
локусу Du281 - три аллельных варианта. При этом обнаружено, что
66
популяция Степанаван является более гетерогенной по сравнению с двумя
другими.
В некоторых случаях высокий уровень гетерогенности у однополых
видов может объясняться множественностью происхождения. Однако,
согласно данным митохондриального и аллозимного анализов, "преклон",
ставший предковым для партеновида D. dahli, возник на ограниченной
территории и в результате единичного акта гибридизации между малым
числом родительских особей, что привело к ни
зкому уровню клонального
разнообразия. Для отдельных популяций нельзя, конечно, исключить
эффекта "бутылочного горлышка'", в результате которого также происходит
уменьшение генетического разнообразия.
Полиморфизм локуса Du323 в популяциях партеновида D. dahli
изучался также и с помощью монолокусного ПЦР [Вергун, 2007]. Из данных,
полученных при амплификации образцов ДНК из разных популяций D. dahli.
следует, что особи из вс
ех популяций D. dahli являются гетерозиготами по
локусу Du323, а также, что исследуемый локус у данного партеновида
представлен тремя различающимися по электрофоретической подвижности
вариантами, при этом популяции различались по частоте встречаемости этих
вариантов.
3.2. Интерпретация результатов молекулярно-биологического анализа в
приложении к исследованиям вариабельных участков генома
Исследования индивидуальных микросателлитных локусов показа
ли, что
изменения, происходящие в них, весьма разнообразны в зависимости от
видов живых организмов, типов повторов, аллелей, а также возраста и пола
[Ellegren, 2000]. При этом партеногенетические рептилии, популяции
которых состоят из генетически идентичных особей, происходящих от одного
предка, являются уникальной природной моделью для изучения
67
молекулярных механизмов изменчивости и эволюции гипервариабельных
повторов ДНК, в частности, таких как микросателлиты [Токарская, 2003].
Существует несколько моделей, объясняющих изменчивость
микросателлитных локусов [Schlotterer, 1992; Weber, 1993; Di Rienzo, 1994;
Kruglyak, 1998]. Большинство из них укладывается в так называемую «шаг за
шагом» модель (“Stepwise mutation model”, SMM), согласно которой
изменения в длине микросателлитных кластеров происходят последовательно
за счёт увеличения или уменьшения длины повтора на одну
мономерную
единицу. В большинстве случаев данные мутации успешно корректируются
механизмами репарации, однако, в единичных случаях происходит изменение
длины микросателлитных ДНК. Наблюдаемые нами различия в длине
микросателлитных кластеров аллельных вариантов локуса Du214 составляют
от одного до семи мономерных единиц, что соответствует «stepwise» модели
(“Stepwise mutation model”,SMM).
Одним из основных механизмов, приводящих к возникновению и
способствующим развитию
микросателлита, является проскальзывание вилок
репликации. В основе этого процесса лежит способность
микросателлитсодержащих последовательностей образовывать
конформационные структуры ДНК – «шпильки» на одной из цепей ДНК,
структуры «проскальзывания» на двунитевой ДНК (вызывают задержки
продвижения ДНК полимеразы) и так называемые тироиды (особые
двунитевые структуры ДНК с 81 п.о. на виток), которые по сути своей
являются
ДНК/ДНК дуплексами [Wells, 1996]. Кроме того, тандемные
повторы способствуют неточной комплементации оснований и, как
следствие, образованию петель. Устойчивость этих выпетливаний
обеспечивается устойчивостью комплементарных взаимодействий между
нуклеотидами во фланкирующих микросателлитный кластер участках
молекулы ДНК, которые также являются ДНК/ДНК-дуплексами. В этой связи
очень важен расчет термодинамических характеристик (изменения
энтропии(∆S), энтальпии (
∆H), энергии Гиббса (∆G)) образования ДНК/ДНК
68
дуплексов, который широко применяется для различных нуклеотидных
последовательностей [Anselmi et al., 2000; Owczarzy et al., 2008], но при этом,
микросателлитные последовательности остаются все еще мало изученными.
Интерпретируя полученные данные (см. таблицы 4 - 6) с точки зрения
молекулярной биологии, мы рассматриваем молекулу ДНК как систему,
устойчивость которой определяется свободной энергией и от нее зависит, в
каком направлении пойдет химическая реакция - в прямом ил
и в обратном.
Ею же определяется конформация - перегибы и сочленения - больших
молекул ДНК, РНК и белков [Симан, 2007]. Любая система всегда стремится
к состоянию с наименьшей свободной энергией. Свободная энергия двух
взаимно дополняющих цепей нуклеотидов минимальна, когда они образуют
двойную спираль, в свою очередь свободная энергия однонитевой молекулы
ДНК минимальна, когда он
а образует ДНК/ДНК-дуплекс - «шпильку» или
комплементарную структуру, удерживающую выпепливание участка
микросателлитного кластера. Возможность микросателлитных
последовательностей образовывать «шпильки» и петли тем больше, чем
больше отрицательное значение ∆G при образовании удерживающего данную
структуру дуплекса и именно образование «шпильки» и петли, а в
дальнейшем и «проскальзывание» цепей ДНК при репликации является
ключевым момен
том в так называемой «шаг за шагом» мутационной
модели[Valdes et al., 1993]. На основании этого можно сказать, что изменения
в микросателлитных кластерах, изучаемых в данной работе, локусов пойдет в
сторону такого числа микросателлитных звеньев, которое обеспечит всему
локусу наименьшее значение ∆G
. Таким образом, можно ожидать, что
ср
изменения локусов Du183, Du365 и Du214, исходя из термодинамических
расчетов, будут направлены в сторону увеличения микросателлитных
кластеров, а изменения локусов Du215, Du255, Du323 и Du281 - в сторону
уменьшения микросателлитного кластера. Данное теоретически рассчитанное
предсказание подтверждается практическими исследованиями, в результате
которых семейный анализ особей D. unisexualis по локусу Du281 показал, что
69
в 4-х исследованных семьях из 24 потомков 9 имели микросателлитный
кластер равный по размеру кластеру в геноме матери, 4 потомка имели
больший по размеру кластер и 11 потомков имели меньший, чем у
материнского организма микросателлитный кластер [Badaeva et al., 2008].
Таким образом, показано, что при случайном характере мутаций с течением
времени в популяциях D. unisexualis происходит преимущественное
накопление аллельных вариантов ло
микросателлитным кластером и с наименьшем значением ∆G
Кроме того, динамика изменения ∆G
куса Du281 с меньшим по размеру
.
ср
среди аллельных вариантов
ср
локусов может служить объяснением того факта, что исследуемые локусы
различны по уровню полиморфизма: Du214 и Du281 имеют по 6 аллельных
вариантов, а локус Du183 - 3 аллеля. Это связано с тем, что микросателлитная
изменчивость локуса Du183 на одно мономерное звено, затрагивает
несколько его кластеров и в плане изменения |∆G
| и модуля суммарной ∆G
ср
соответствует изменению микросателлитов локусов Du214 и Du281 на
несколько мономерных звеньев (см. таблицу 6 и таблицу 7). Следовательно,
изменения в мономерном составе микросателлита локуса Du183 за равный
промежуток времени и на одинаковое значение ∆G должны быть менее
значительными, чем у локусов Du214 и Du281. Таким образом, возможно, в
популяциях D. unisexualis накапливается меньшее число аллельных ва
риантов
локуса Du183 и большее число аллельных вариантов локусов Du214 и Du281.
Микросателлитные последовательности в целом и микросателлиты GT-
типа в частности способны образовывать большое количество
неканонических структур ДНК. К таким структурам относятся G-
квадруплексы, параллельные дуплексы, триплексы [Калюжный c соавт.,
2008]. Известно, что ДНК-полимераза может замедляться или
останавливаться на стабильных шпильках, триплексах и квадруплексах при
том, что количес
тво повторов является критическим параметром для
образования разного рода неканонических структур [Сиянова, Миркин, 2001].
Таким образом, мутации микросателлитных кластеров приводящие либо к
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]