Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis. Монография
.pdf
В современной литературе существует множество различных
алгоритмов и методик расчета энтропийных и энтальпийных характеристик
образования вторичных структур молекулы ДНК и прочих вариантов
формирования ДНК/ДНК дуплексов [Owczarzy et al., 2001; 2008; Anselmi et
al., 2000; Nazarenko et al., 2002; SantaLucia et al., 2004]. Наиболее применимой
из них является расчет указанных показателей как с учетом энергии
образования водородных связей, так и с учетом стэкинг-взаимодейсвий
между соседними основаниями (см. табл. 1). При этом точные молекулярные
массы, выраженные в г/моль представлены в таблице 2.
Таблица 1 - Термодинамические параметры для ДНК/ДНК дуплексов
при учете взаимовлияния соседних пар оснований.
Соседние пары оснований
(5'-3'/5'-3')
ΔH,
ккал/моль
AA/TT -7.9 -22.2
AG/CT -7.8 -21.0
AT/AT -7.2 -20.4
AC/GT -8.4 -22.4
GA/TC -8.2 -22.2
GG/CC -8.0 -19.9
GC/GC -9.8 -24.4
TA/TA -7.2 -21.3
TG/CA -8.5 -22.7
CG/CG -10.6 -27.2
Таблица 2 - Молекулярные массы нуклеотидов.
, г/моль 313.209
M
dA
MdC, г/моль 289.184
MdG, г/моль 329.208
MdT, г/моль 304.196
MdU, г/моль 290.169
M
г/моль 314.194
dI,
ΔS,
ккал/(моль·K)
11
1.2. Вариабельность генома и генетико-популяционные исследования
Эффективность геномных исследований, целенаправленность
молекулярно-биологических и биохимических приемов и методов при
изучении параметров и свойств молекулы ДНК в значительной степени
зависят от правильного выбора системы детекции объекта исследований. В
связи с этим особое значение приобретают генетические и биохимические
маркеры, свойства, преимущества и недостатки
которых напрямую
становятся успехами и неудачами решения тех или иных исследовательских
задач.
1.2.1. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях
Классификация маркеров в генетических исследованиях до сих пор не
сформирована, что объясняется не только их многообразием, но и тем, что
при введении тех или иных модификаций в известный метод, авторы часто
дают
новое наименование получаемым ими маркерам. В связи с этим,
например, предложено объединить ДНК-маркеры, созданные на основе ПЦР,
в два основных класса: маркеры, созданные на основе небольших изменений
в нуклеотидной последовательности ДНК уникальных локусов, и маркеры на
основе изменения числа повторов в тандемно повторяющихся
последовательностях ДНК [Schlotterrer, 2004]. Очевидно, что такая
классификация недостаточна
, поскольку перечисленные классы гетерогенны
и включают в себя ДНК-маркеры, резко различающиеся по своим свойствам.
Кроме того, сюда не включены маркеры, которые использовались как
мономорфные маркеры при построении физических карт хромосом человека
и других организмов.
Первая попытка систематизации ДНК-маркеров была предложена в 1989
году Ольсоном с соавторами [Olson et al., 1989]. Им была сформулирована
идея создания системы STS-маркеров, которая была призвана
12
стандартизовать все обозначения маркированных последовательностей ДНК в
геноме и включить в себя все типы картированных последовательностей.
"Перевод" всех обозначений на язык STS позволил анализировать
данные по маркерам через базы данных и оптимизировать процесс
"насыщения" маркерами физических карт геномов человека и животных.
Создание единой базы данных для STS-маркеров способствовало лучшему
взаимодействию разных лаб
ораторий и увенчалось, в конечном итоге,
построением тонких физических карт хромосом и секвенированием геномов
человека и ряда других объектов [см. компьютерные базы данных: NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Genethon (carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-
bin/contig/phys_map), CEPH-Genethon (www.cephb.fr/bio/ceph-genethon-
map.html), GDB (Genome Data Base) (http://www.gdb.org/), и др.]. В данной
работе мы придерживаемся классификации, предложенной [Сулимова, 2004]
и обобщенной нами в виде схемы на рисунке 2.
Маркеры
Биохимические
маркеры
Маркеры
основанные на
ПЦР
Мономорфные
ДНК-маркеры
Ретроэлементы
LINE-элементы
ок 2 – Классификация маркеров, используемых в генетических
Рисун
SINE-элементы
RAPD-маркеры
AFLP-маркеры
Полиморфные
ДНК-маркеры
ДНК-маркеры
множественной
локализации
Микросателлиты
ISSR-маркеры IRAP-маркеры
ДНК-маркеры
Маркеры на основе
исследованиях.
13
ПДРФ
SNP-маркеры
1.2.2. Математическое моделирование генетико-популяционных
процессов
Современная биология активно использует различные разделы
математики: теорию вероятностей и статистику, теорию дифференциальных
уравнений, теорию игр, дифференциальную геометрию и теорию множеств
для формализации представлений о структуре и принципах
функционирования живых объектов [Резниченко, 2002].
В связи с индивидуальностью биологических явлений существуют
некоторые отличия математических моделей в биологии от матема
тических
моделей в других областях человеческого знания. Слово модель здесь
подчеркивает то обстоятельство, что речь идет об абстракции, идеализации,
математическом описании скорее не самой живой системы, а некоторых
качественных характеристик протекающих в ней процессов. При этом удается
сделать и количественные предсказания, иногда в виде статистических
закономерностей. В отдельных случаях, например, в биотехнологи
и,
математические модели, как в технике, используются для выработки
оптимальных режимов производства.
В основе любых моделей лежат некоторые предположения. Модель,
построенная на основе этих предположений, становится самостоятельным
математическим объектом, который можно изучать с помощью арсенала
математических методов. Ценность модели определяется тем, насколько
характеристики модели соответствуют свойствам моделируемого объекта.
Все б
иологические системы различного уровня организации, начиная от
биомакромолекул вплоть до популяций, являются термодинамически
неравновесными, открытыми для потоков вещества и энергии [Базыкин,
2003]. Поэтому нелинейность - неотъемлемое свойство базовых систем
математической биологии. Несмотря на огромное разнообразие живых
систем, можно выделить некоторые важнейшие присущие им качественные
свойства: рост, самоограничение роста, способность к переключениям -
14
существование в двух или нескольких стационарных режимов,
автоколебательные режимы (биоритмы), пространственная неоднородность,
квазистохастичность. Все эти свойства можно продемонстрировать на
сравнительно простых нелинейных динамических моделях, которые и
выступают в роли базовых моделей математической биологии.
1.2.2.1. Классификация математических моделей в биологии, классы
задач и математический аппарат
При разработке любой модели необходимо определить
объект
моделирования, цель моделирования и средства моделирования. В
соответствии с объектом и целями математические модели в биологии можно
подразделить на три больших класса: регрессионные модели, имитационные
модели и базовые модели [Апонин, 2007].
Регрессионные модели, включает эмпирически установленные
зависимости (формулы, дифференциальные и разностные уравнения,
статистические законы) не претендующие на раскрытие механизма
изучаемого процесса
. Коэффициенты в регрессионных моделях обычно
определяются с помощью процедур идентификации параметров моделей по
экспериментальным данным. При этом чаще всего минимизируется сумма
квадратов отклонений теоретической кривой от экспериментальной для всех
точек измерений. То есть коэффициенты модели подбираются таким образом,
чтобы минимизировать функционал:
где i - номер точки измерения;
x
- экспериментальные значения переменных;
e
- теоретические значения переменных;
х
t
a
, a2... - параметры, подлежащие оценке;
1
- "вес" i-го измерения;
w
i
15
, (2)
n - число точек измерения.
Имитационные модели – это модели конкретных сложных живых
систем, как правило, максимально учитывающие имеющуюся информацию
об объекте. Имитационные модели применяются для описания объектов
различного уровня организации живой материи - от биомакромолекул до
моделей биогеоценозов. В последнем случае модели должны включать блоки,
описывающие как живые, так и "косные" компоненты. Кла
ссическим
примером имитационных моделей являются модели молекулярной динамики,
в которых задаются координаты и импульсы всех атомов, составляющих
биомакромолекулу и законы их взаимодействия. Вычисляемая на компьютере
картина "жизни" системы позволяет проследить, как физические законы
проявляются в функционировании простейших биологических объектов -
биомакромолекул и их окружения. Сходные модели, в которых элементами
(кирпичиками) уже яв
ляются не атомы, а группы атомов, используются в
современной технике компьютерного конструирования биотехнологических
катализаторов и лекарственных препаратов, действующих на определенные
активные группы мембран микроорганизмов, вирусов, или выполняющих
другие направленные действия. Имитационные модели созданы для описания
физиологических процессов, происходящих в жизненно важных органах:
нервном волокне, сердце, мозге, желудочно-кишечном тракте, кровеносном
русле. На ни
х проигрываются "сценарии" процессов, протекающих в норме и
при различных патологиях, исследуется влияние на процессы различных
внешних воздействий, в том числе лекарственных препаратов. Имитационные
модели широко используются для описания продукционного процесса
растений и применяются для разработки оптимального режима выращивания
растений с целью получения максимального урожая, или получения наиболее
равномерно расп
ределенного во времени созревания плодов [Ризниченко,
1999]. Особенно важны такие разработки для дорогостоящего и энергоемкого
тепличного хозяйства.
16
В любой науке существуют простые модели, которые поддаются
аналитическому исследованию и обладают свойствами, которые позволяют
описывать целый спектр природных явлений. Такие модели составляют
третий класс математических моделей в биологии и называются базовыми
моделями. Базовыми моделями в биологии являются: модель
неограниченного роста Т.Р. Мальтуса, модель ограниченного роста
Ферхюльста, модели ограничения по
субстрату Моно и Михаэлиса-Ментен,
модели взаимодействия видов Лотки и Вито Вольтерра и многие другие.
Базовые модели, как правило, подробно изучаются в различных
модификациях. После того, как досконально математически изучена суть
процессов на такой базовой модели, по аналогии становится понятными
явления, происходящие в гораздо более сложных реальных системах.
Например, релаксация
конформационных состояний биомакромолекулы
рассматривается аналогично осциллятору в вязкой среде. Таким образом,
благодаря простоте и наглядности, базовые модели становятся чрезвычайно
полезными при изучении самых разных биологических систем
[Брусиловский, 1983]. Базовые модели математической биологии в виде
простых математических уравнений отражают самые главные качественные
свойства живых систем: возможность роста и его ограниченность,
способность к
переключениям, колебательные и стохастические свойства,
пространственно-временные неоднородности. На этих моделях изучаются
принципиальные возможности пространственно-временной динамики
поведения систем, их взаимодействия, изменения поведения систем при
различных внешних воздействиях - случайных, периодических и т.п.
Любая индивидуальная живая система требует глубокого и детального
изучения, экспериментального наблюдения и построения своей собственной
модели, сложность которой
зависит от объекта и целей моделирования.
17
1.2.2.2. Математическое моделирование генетических процессов на
популяционном и видовом уровне
Описание изменения численности и других характеристик дискретных
во времени популяций составляет предмет популяционной динамики.
Популяционная динамика является частью математической биологии,
наиболее развитой в смысле формального математического аппарата, своего
рода "математическим полигоном" для проверки теоретических идей и
представлений о законах роста и э
волюции биологических видов, популяций,
сообществ. Популяционная динамика представляет собой область
математической биологии, описывающая с помощью моделей типы
динамического поведения развивающихся систем, представляющих собой
одну или несколько взаимодействующих популяций или
внутрипопуляционных групп [Левич, 2002]. Отличительной чертой
биологических популяций, как и всех живых систем, является их удаленность
от термодинамического равновесия, использование для своего роста и
развития энергии вн
ешних источников. Это обуславливает необходимость
использования для описания таких систем нелинейных моделей,
позволяющих отразить основные характерные черты популяционной
динамики лабораторных и природных популяций. Это - ограниченность
роста, вызванная совокупностью факторов, возможность нескольких
стационарных исходов в зависимости от начальных условий роста популяции,
"зависание" системы вблизи критической границы и ее чувс
твительность в
этой области к малым флуктуациям и индивидуальным усилиям,
запаздывание реакции системы на изменение внешних факторов,
возможность колебательных и квазистохастических режимов [Резниченко,
2003].
Математические результаты, полученные при изучении моделей
популяционной динамики служат для практических целей управления
18
биотехнологическими и природными системами и, дают пищу для развития
собственно математических теорий.
Возможность описания популяций различной биологической природы
одинаковыми математическими соотношениями обусловлена тем, что с
динамической точки зрения, рост и отбор организмов в процессе эволюции
происходит по принципу "кинетического совершенства" [Шноль, 1979].
Преимущества математического анализа любых, в том числе
популяционных, процессов, очевидны. Матема
тическое моделирование не
только помогает строго формализовать знания об объекте, но иногда (при
хорошей изученности объекта) дать количественное описание процесса,
предсказать его ход и эффективность, дать рекомендации по оптимизации
управления этим процессом.
Наиболее распространенными математическими моделями
популяционной биологии являются: дискретные модели популяций с
перекрывающимися и неперекрывающимися поколениями, матричные
модели популяций, ст
руктурные модели популяций и математические модели
взаимодействия двух популяций.
19
2. Исследование микросателлитных динуклеотидных локусов генома
партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis
2.1. Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих
-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis.
(TG)
n
Для молекулярной характеристики (TG)
микросателлитных локусов у
n
партеновида из геномной клонотеки D. unisexualis содержащей 1000
рекомбинантных клонов было отобран 51 клон.
Для уточнения количества колоний дающих положительный сигнал все
отобранные колонии были проверены методом блот-гибридизации с (TG)
зондом, меченым [γ
только 25 колоний из 51 содержали (TG)
32
P]- ATP. Как показали результаты блот-гибридизации
-микросателлитные кластеры.
n
-
9
Выбор рекомбинантных клонов осуществлялся на основании картины блот-
гибридизации, где учитывались яркость и четкость гибридизации, а также
количество фрагментов в рекомбинантном клоне. Таким образом, из общего
числа возможных вариантов преимущество в дальнейших исследованиях
получали клоны однозначно гибридизовавшиеся с (TG)
32
P]- ATP и имеющие только одну вставку. Всем выше указанным
[γ
-зондом, меченым
9
критериям отвечали 5 из 25 рекомбинантных клонов. Секвенирование и
последующий компьютерный анализ подтвердил наличие в указанных 5
рекомбинантных клонах протяжённых (TG)
-кластеров. В таблице 3
n
приведена структура микросателлитных кластеров локусов, содержащих
(GT)
-микросателлиты.
n
Таблица 3 - Локусы, содержащие (GT)
n
Микросателлитный
Название локуса
кластер Размер локуса, п.н.
Du231 (Ac. № EU252540) (GT)
20
-микросателлиты
14
573
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]