Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis. Монография
.pdf
Du365 (Ac. № EU252543) GTGGA(GT)
Du255 (Ac. № EU252541) (GT)22(AT)
Du214 (Ac. № EU252542) (GT)
22
12
22
Du183 (Ac. № EU252539) (TG)10(AG)7(G)7(AGG)
540
657
558
10
368
На осно
ве секвенированной последовательности был осуществлен
подбор праймеров для ПЦР-анализа вариабельности данных участков
молекулы ДНК. Результаты подбора праймеров представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Условия ПЦР-амплификации пяти микросателлитных локусов
партеновида D. unisexualis.
Размер
ПЦР-
Название
локуса Пара праймеров
Du231(Ac. №
EU252540)
Du365(Ac. №
EU252543)
Du255(Ac. №
EU252541)
Du183(Ac. №
EU252539)
Du214(Ac. №
EU252542)
. Анализ изменчивости микросателлитных локусов у партеновида D.
2.2
5’TCAAGAGGCCTCCCGAAAAG 3’ (F)
5’TGAGCCAGCTACCGTCATTCA3’ (R)
5’GGGGCCCATTGTGTAAATACTGTA 3’ (F)
5’GGATTAAGGGGTTTTCTCAGGACA3’ (R)
5’TCGCAGAGTGGCAGGAAACAAT 3’ (F)
5’TGCATCCAGCTCAACCAAAATACC 3’ (R)
5’ACAGACAAACACTCATAGAACACAT 3’ (F)
5’AATCAACAAGCCAAGAACAAAC3’ (R)
5’TCACTTAAGGTTGACGCTGACTCA 3’ (F)
Температура
отжига, °С
56
55
58
51
50
продукта,
п.н.
160
254
212
201
2235’CTGAACAAGTTGTCCACCTCTGC3’ (R)
unisexualis.
С помощью ПЦР-амплификации в данной работе было
проанализировано 65 особей на выборке из пяти популяций D. unisexualis.
Участки ДНК соответствующие локусам Du213, Du255 и Du365 оказались
электрофоретически мономорфными и фиксировано гетерозиготными. На
21
рисунке 3 представлена типичная картина ПААГ электрофоретического
разделения выборки особей D. unisexualis характерная для локуса Du231.
ок 3 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du231 D. unisexualis. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
На рисунке 4 представлена типичная картина ПААГ
электрофоретического разделения выборки особей D. unisexualis характерная
для локуса Du255.
ок 4 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du255 D. unisexualis. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
На рисунке 5 представлена типичная картина ПААГ
электрофоретического разделения выборки особей D. unisexualis характерная
для локуса Du365.
22
ок 5 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du365 D. unisexualis. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
Участки ДНК соответствующие локусам Du183 и Du214 оказались
электрофоретически также фиксировано гетерозиготными, но в отличие от
локусов Du231, Du255 и Du365, полиморфными. Однако, ПЦР-анализ
показал, что локусы Du183 и Du214 полиморфны в разной степени – локус
Du183 п
редставлен 3-мя аллельными вариантами, а локус Du214 представлен
6-ю аллельными вариантами. Причем, все три аллельных варианта в случае
последовательности ДНК локуса Du183 принадлежат особям популяции
Токярлу. На рисунке 6 показана выборка из особей популяции Токярлу,
содержащая все аллельные варианты, характерные для этого участка
молекулы ДНК партеновида D. unisexualis.
ок 6 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du183 популяции Токярлу партеновида D. unisexualis. Цифрами
указаны аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
23
ПЦР-анализ аллельных вариантов локуса Du214 показал, что
распределение аллельных вариантов среди особей D. unisexualis различно в
популяциях партеновида. Так, популяция Кутчак содержит пять аллельных
вариантов исследуемого локуса. На рисунке 7 показана выборка из особей
популяции Кутчак партеновида D. unisexualis. Популяция Лчап содержит два
аллельных варианта локуса Du214. На рисунке 8 показана выборка из особей
популяции Лчап парте
новида D. unisexualis. Популяция Загалу содержит
также два аллельных варианта локуса Du214. На рисунке 9 показана выборка
из особей популяции Загалу партеновида D. unisexualis. Популяция Норатус
содержит те же два аллельных варианта локуса Du214. На рисунке 10
показана выборка из особей популяции Норатус партеновида D. unisexualis.
В отличии от них популяция Токярлу содержит уже три аллельных варианта
локуса Du214
. На рисунке 11 показана выборка из особей популяции Токарлу
партеновида D. unisexualis. Совокупная количественная оценка
распространенности аллельных вариантов локуса Du214, демонстрирующая
частоту встречаемость данных вариантов нуклеотидных последовательностей
указанного локуса в популяциях партеновида D. unisexualis представлена в
таблице 5.
ок 7 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du214 популяции Кутчак партеновида D. unisexualis. Цифрами
указаны аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
24
ок 8 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du214 популяции Лчап партеновида D. unisexualis. Цифрами указаны
аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса использовали
50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
ок 9 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du214 популяции Загалу партеновида D. unisexualis. Цифрами указаны
аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса использовали
50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
ок 10 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du214 популяции Норатус партеновида D. unisexualis. Цифрами
указаны аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
25
ок 11 - Электрофорез в 8% нативном ПААГ выборки ПЦР-продуктов
Рисун
локуса Du214 популяции Такярлу партеновида D. unisexualis. Цифрами
указаны аллельные варианты. В качестве маркера молекулярного веса
использовали 50 bp Ladder (“Fermentas”, Литва) с шагом 50 п.н.
Таблица 5 - Количественная оценка вариабельности локуса Du214 у
партеновида D. unisexualis.
Общее
число
Популяция Аллельный вариант
ант 1 вариант 2вариант 3вариант 4 вариант 5вариант
вари
особей
6
Кутчак 0 872 2110
Лчап 0 10 10 0 0 0 10
Загалу 0 11 11 0 0 0 11
Норатус 0 17 17 0 0 0 17
Такярлу 12 17 5 0 0 0 17
По всем
популяциям 12 63 50 2 2 1 65
. Сравнительный анализ биохимических и физико-химических
2.3
характеристик микросателлитных локусов генома D.unisexualis.
Исследование первичной последовательности участков молекулы ДНК
соответствующих локусам Du183, Du214, Du231, Du255 и Du365 показало,
что влияние микросателлитного кластера на биохимические и молекулярно-
биологические свойства молекулы ДНК в данных областях различно в
зависимости от протяженности и сложности микросателлитного кластера.
26
Согласно полученным данным локус Du183 имеет в своем составе
сложный микросателлит, состоящий из различных микросателлитных
кластеров, вплотную прилегающих друг к другу: (TG)
, (АG)n, (G)n и (AGG)n.
n
График, демонстрирующий изменение процентной доли нуклеотидов
первичной последовательности ДНК в зависимости от размера
рассматриваемого участка ДНК, для локуса Du183 показан на рисунке 12.
ок 12 – Процентная доля нуклеотидов для локуса Du183. Цветом
Рисун
показаны процентные доли различных нуклеотидов: зеленый – аденин, синий
– цитози
пар
н, черный – гуанин, красный – тимин. Вертикальными линиями
аллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
Видно, что наличие микросателлитного кластера сказывается на
нуклеотидном составе локуса Du183 неоднозначно – например снижение
процентной доли цитозина практически не зависит от микросате
ллитного
кластера, т.к. её снижение началось за 51 нт. до микросателлита. Процентное
27
,
содержание аденина и тимина практически не изменяется до
микросателлитного кластера – 34,1% и 21,6% и после микросателлита – 30,8%
и 18,7%. В то же время доля гуанинов сильно повышается в ходе увеличения
микросателлитного участка, даже в независимости от типа
микросателлитного кластера – от 23,9% до 38,3%. В целом, можно сказать,
что микросателлит вносит значительный дисбаланс в нуклеотидный состав
локуса Du183, а п
оследовательность молекулы ДНК после
микросателлитного кластера стабилизируется и процентные доли
нуклеотидов остаются практически константными.
Дестабилизирующее влияние микросателлита сказывается также и на
таком молекулярно-биологическом параметре молекулы ДНК как
молекулярная масса. На рисунке 13 показан график изменения абсолютной
молекулярной массы 3’-5’ и 5’-3’ последовательностей локуса Du183.
Рисун
ок 13 – Величина молекулярной массы последовательности ДНК для
локуса Du183. Цветом показана абсолютная молекулярная масса: красным –
5’ – 3’ последовательности, синим – 3’ – 5’ последовательности.
28
Вертикальными линиями, параллельными оси ординат, показана проекция
микросателлитного кластера на график.
Видно, что до микросателлита последовательность локуса Du183 была
сбалансирована по молекулярной массе, а на протяжении микросателлита и
после микросателлита молекулярные массы 3’-5’ и 5’-3’ последовательностей
значительным образом расходятся. Детальное влияние микросателлитных
кластеров на молекулярную массу локуса Du183 показано на рисунке 14, где
изображен график
модуля разности молекулярных масс. Видно, что вне
зависимости от типа микросателлитного кластера совокупное влияние
микросателлита приводит к значительному различию в величине
молекулярных масс, равному 2300 г/моль в месте окончания микросателлита.
Рисунок 14 – Модуль разности молекулярных масс 5’-3’ и 3’-5’
последовательностей ДНК локуса Du183. Вертикальными линиями,
параллельными оси ординат, показана проекция микросателлитного кластера
на график.
Для описания, изучения и объяснения ряда важных молекулярно-
биологических процессов, характеристики интенсивности и направления
29
биохимических реакций, в которых непосредственно задействованы участки
изучаемых в настоящей работе последовательностей ДНК, было предпринято
исследование влияния микросателлитных кластеров на такую важную
биохимическую характеристику как свободная энергия образования
ДНК/ДНК-дуплекса. На рисунке 15 показан график изменения свободной
энергии на протяжении последовательности локуса Du183. Из этих данных
следует, что влияние различных кластеров сложного микроса
Du183 не однородно. Так увеличение динуклеотидного (TG)
приводит к уменьшению ∆G
динуклеотидного (АG)
= -6899 Дж/моль. Увеличение моно- и тринуклеотидного кластеров
∆G
ср
-кластера приводит к увеличению ∆Gср до значения
n
приводит к заметному снижению ∆G
(∆Gср = -6921 Дж/моль), увеличение
ср
до значения ∆Gср= -7016 Дж/моль.
ср
теллита локуса
-кластера
n
ок 15 - Средняя свободная энергия образования ДНК/ДНК-дуплекса для
Рисун
локуса Du183. Вертикальными линиями, параллельными оси ординат,
показана проекция микросателлитного кластера на график.
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]