Основы биохимии. Динамическая биохимия. Практикум для СПО

Контрольные вопросы и задания

1.Зарисуйте в цвете и запишите уравнения проделанных реакций.

2.Сделайте вывод о проделанной работе.

3.Перечислите, какие питательные вещества содержит молоко.

Лабораторная работа № 2.

Определение качества молока и молочных продуктов

Цель работы — провести количественное определение содержания лактозы в молоке и молочных продуктах.

Опыт 1. Определение содержания лактозы

цианидным способом

Оборудование и реактивы: водяная баня, электроплитка, бюретка, мерный цилиндр, мерная колба на 250 мл, коническая колба на 100 мл, термометр, конические колбы на 100 и 250 мл, воронка, фильтры «Белая лента», мерный пальчик, 1 % раствор гексацианоферрата (III) калия, 20 % раствор ZnSO4, раствор NaOH (с = 2,5 моль/л), 0,2 % раствор метиленовой сини, дистиллированная вода, молоко.

Для определения содержания лактозы в молоке и в молочных продуктах можно использовать метод Бертрана или цианидный метод. Второй метод основан на способности редуцирующих сахаров восстанавливать в щелочном растворе красную кровяную соль К3[Fe(CN)6] в желтую К4[Fe(CN)6] при нагревании. В качестве индикатора используют метиленовую синь, которая в конце реакции восстанавливается лактозой с образованием бесцветного соединения.

61

Ход работы:

1.Приготовление испытуемого раствора лактозы: в мерную колбу на 250 мл с помощью бюретки налить 25 мл молока. Остатки смыть дистиллированной водой объемом не более 150 мл. Колбу поставить на водяную баню при 60 ºС на 15 мин. и периодически перемешивать. Затем колбу охладить и для осаждения белков добавить 3– 4 мл 20 % раствора ZnSO4 и 1,5–2 мл раствора NaOH. Смесь встряхнуть, довести объем раствора водой до метки, перемешать, дать осадку отстояться 10–15 мин. и отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу. Раствор готов для анализа.

2.Определение лактозы: в бюретку налить раствор лактозы.

Вконическую колбу на 100 мл с помощью мерного цилиндра налить 10 мл 1 % раствора К3[Fe(CN)6], 2,5 мл раствора NaOH и одну каплю метиленовой сини. Смесь поставить на электроплитку и нагреть до кипения. Поддерживая слабое кипение, смесь оттитровать испытуемым раствором (приготовленным раствором лактозы), добавляя его примерно по 1 капле в секунду, до перехода зеленой окраски (через фиолетовую) в светло-желтую.

При охлаждении раствор приобретает фиолетовую окраску из-за окисления бесцветной формы метиленовой сини кислородом воздуха.

Массовая доля лактозы в молоке рассчитывается по формуле:

где — содержание лактозы, %; 0,012 — масса лактозы, необходимой для восстановления 10 мл

1 % раствора К3[Fe(CN)6], г;

V1 — общий объем испытуемого раствора, равный 250 мл;

62

V2 — объем испытуемого раствора, пошедшего на титрование 10 мл раствора К3[Fe(CN)6];

m — масса молока (25 г).

Пример расчета. На титрование 10 мл раствора К3[Fe(CN)6] израсходовано 2,9 мл испытуемого раствора лактозы:

Опыт 2. Определение кислотности молока

Оборудование и реактивы: бюретка, коническая колба на 50– 100 мл, пипетка, мерный цилиндр, 0,1 н раствор NaOH, 2 % спиртовой раствор фенолфталеина, молоко, дистиллированная вода.

При определении доброкачественности молока прежде всего определяют его кислотность. Кислотные свойства свежего молока обусловливаются белками, гидрофосфатами и гидроцитратами, дающими ионы водорода. При хранении молока кислотность его повышается вследствие образования молочной кислоты из молочного сахара под влиянием ферментов, выделяемых молочнокислыми бактериями, попадающими из воздуха. Образующаяся молочная кислота осаждает белок — казеин.

Кислотность молока принято выражать в градусах Тернера (Т). Ход работы: 10 мл молока вносят пипеткой или мерным цилин-

дром в колбу, добавляют 20 мл дистиллированной воды и 3–5 капель фенолфталеина, смесь взбалтывают. Затем проводят титрование 0,1 н раствором NaOH до появления слабо-розового цвета, не исчезающего в течение 1–2 мин. Число мл раствора щелочи, пошедших на нейтрализацию взятого объема молока, умноженное на 100 (расчеты ведут на 100 мл), показывает кислотность молока в градусах Тернера.

63

Опыт 3. Количественное определение белков

в молоке и кисломолочных продуктах

Оборудование и реактивы: стакан, весы аналитические, цилиндр, пипетка, бюретка, спиртовой раствор фенолфталеина, 0,1 н раствор щелочи, нейтральный формалин (50 мл тонарного формалина (концегтривованный формлаин) концентрация (40 %) + 0,5 мл фенолфталеина и по каплям 0,1 н р-р щелочи до исчезающего розового окрашивания).

Ход работы: в коническую колбу на 50 мл вносят 10 мл молока, затем прибавляют 10–12 капель спиртового раствора фенолфталеина и тируют 0,1 н раствором щелочи до розового окрашивания, не исчезающего после взбалтывания. После этого приливают нейтральный раствор формалина — 2 мл, при этом розовый цвет исчезает, титрование продолжают до слабо-розового окрашивания. Количество мл 0,1 н NaOH, израсходованное после прибавления формалина, умножить на 1,92, получают содержимое белка в молоке:

где Б — содержание белка в исследуемом продукте, %; Х — количество щелочи, пошедшее на титрование, мл.

Аналогично делают определение для сметаны, кефира, творога, где берут 5 г продукта и умножают на 2.

Норма белков в молоке (кефире и других кисломолочных продуктах) — 2–8 %.

Контрольные вопросы и задания

1.Запишите уравнения реакции восстановления редуцирующих сахаров (в щелочном растворе).

2.Оформите работу в тетради, сделайте выводы о качестве молока и молочных продуктов на основании полученных результатов.

64

Литература:

1.Биологическая, физическая и коллоидная химия : методические указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического ф-та спец. «Зоотехния» / составители : В. В. Осташкова, В. П. Андреев, Я. П. Нижник ; редактор : Л. П. Соколова. — Петрозаводск : Изд-во ПетрГУ, 2007. — 100 с.

2.Болдырева, О. И. Методы исследования пищевых продуктов : методические указания к лабораторным работам / О. И. Болдырева, Е. М. Мозгунова. — Оренбург : ОГУ, 2012. — 70 с.

3.Большой практикум «Биохимия» : лабораторные работы : учебное пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению «Биология» / составители : М. Г. Кусакина, В. И. Суворов, Л. А. Чудинова. — Пермь : Пермский гос. нац. исслед.

ун-т, 2012. — 147 с.

4.Методическое пособие для практических занятий по биохимии / Е. И. Ерлыкина, П. П. Загоскин, С. П. Калашников, Т. И. Шлапакова, Т. С. Семенова, Л. И. Якобсон, О. И. Александрова. — Нижний Новгород : Изд-во Нижегородской гос. мед. академии, 2008. — 70 с.

5.Методическое пособие к малому практикуму по биохимии / составители : С. А. Коннова, А. А. Галицкая, Е. В. Плешакова, Е. С. Тучина ; под общей редакцией В. В. Игнатова. — 5-е изд., перераб. и доп. — Саратов : Изд-во Саратовского ун-та, 2013. — 73 с. :

6.Методическое руководство для практикума по биохимии : учебно-методическое руководство / Н. С. Сиянова, Т. А. Невзорова, С. Н. Неуструева. — Казань : КГУ, 2008. — 46 с.

7.Ушакова, Г. О. Лабораторный практикум к учебной дисциплине «Биохимия» / Г. А. Ушакова, О. А. Дёмшина — Днепропетровск : Полиграфический издат. центр «Арбуз», 2015. — 61 с.

65

5. ЛИПИДЫ И ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН

УСТАНОВЛЕНИЕ КАЧЕСТВА ЖИРОВ

Лабораторная работа № 1.

Установление качества жиров

Цель работы — установить на основе количественного определения основных характеристик жиров качество продукта.

Опыт 1. Определение насыщенности

(йодное число) жиров

Оборудование и реактивы: весы аналитические, бюретка, колбы конические на 100 мл, пипетка на 3 мл, хлороформ, 0,001 н раствор йода в хлороформе, различные жиры (масло (сливочное или подсолнечное), маргарин, спред).

Ненасыщенность жира зависит от присутствия в его составе непредельных жирных кислот. Ненасыщенные соединения легко присоединяют по два атома галогена по месту каждой двойной связи. Обычно степень ненасыщенности определяют йодным числом. Йодное число измеряется количеством граммов йода, которое присоединяется к 100 г жира.

Йодное число является одним из наиболее важных химических показателей для масел (жиров). Оно позволяет судить о степени ненасыщенности масла (жира), о склонности его к «высыханию», прогорканию и другим изменениям, происходящим при хранении и переработке пищевых и технических масел.

С двойными связями кроме йода реагируют также и другие галогены — хлор и бром. Однако они не только присоединяются по

66

двойным связям, но и замещают атомы водорода в радикале. Йод же в определенных условиях реагирует преимущественно с двойными связями.

Ход работы: на аналитических весах взвесить навеску жиров (0,5 г) и перенести в коническую колбу. Растворить жир в 3 мл хлороформа и оттитровать из бюретки 0,001 н раствором йода в хлороформе до отчетливой розовой окраски. Записать объем раствора йода, пошедшего на насыщение жиров.

Опыт 2. Определение йодного числа

титрованием тиосульфатом натрия

Оборудование и реактивы: весы аналитические, пробирки, пипетка градуированная на 10 мл, колбы конические на 250 мл с пробками, бюретка, цилиндр мерный на 100 мл, растительное масло, этиловый спирт, 0,2 н раствор йода в 96 % этиловом спирте (25,4 г свежевозогнанного йода переносят в мерную колбу на 1000 мл и растворяют в спирте), 0,1 н раствор гипосульфита натрия, 1 % раствор крахмала.

Ход работы: в сухую коническую колбу емкостью 250 мл с пришлифованной стеклянной пробкой поместить исследуемое масло. Навеску взять на аналитических весах следующим образом: взвесить колбу с маслом, внести в колбу 3–4 капли растительного масла и снова взвесить склянку. По разности масс определить величину навески масла. Далее в колбу добавить 25 мл спирта для растворения навески. Если масло плохо растворяется, можно подогреть колбу на водяной бане. Во второй колбе ставится контрольная проба, в нее надо налить 25 мл спирта. В каждую колбу (опыт и контроль) прибавить по 12,5 мл 0,2 н спиртового раствора йода (из бюретки или электронным дозатором), смешать, прилить по 100 мл дистиллированной воды и

67

хорошо встряхнуть, закрыв пробкой. Через 5 мин. содержимое колб оттитровать 0,1 н раствором тиосульфата натрия сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл 1 % раствора крахмала, титровать до исчезновения синего окрашивания.

Разность между количеством 0,1 н раствора тиосульфата, затраченного на титрование опыта и контроля, является показателем количества йода, связанного навеской масла. Расхождения в параллельных опытах допускаются лишь в десятых долях получаемых йодных чисел.

Йодное число (в г) вычисляется по формуле

где Х — йодное число;

V1 — количество 0,1 н раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование контроля, мл;

V2 — количество 0,1 н раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование в опыте, мл;

0,0127 — титр тиосульфата по йоду; Н — навеска жира, г.

Опыт 3. Определение перекисного числа

Оборудование и реактивы: весы аналитические, колбы конические на 150–200 мл, пипетки, масло или жир (можно спред), хлороформ, CH3COOH (ледяная), раствор KI, 1 % раствор крахмала, 0,01 н раствор Na2S2O3.

В присутствии кислорода воздуха входящие в состав жиров кислоты могут частично окисляться и образовывать перекиси. Это явле-

68

ние наблюдается при порче жиров, а также при их высыхании. Таким образом, перекисное число служит показателем окислительных изменений жиров. Обычно перекисное число выражается в граммах йода, который выделяется из KI перекисями, содержащимися в 100 г жира.

Определение перекисного числа основано на том, что перекиси жира в кислой среде способны реагировать с йодистым калием, выделяя из него йод. Схематически эта реакция может быть представлена так:

Выделяющийся йод оттитровывают раствором гипосульфита:

2Na2S2О3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6.

По количеству гипосульфита, затраченному на связывание выделившегося йода, вычисляют перекисное число.

Ход работы: на аналитических весах взвешивают около 1 г жира (маргарина, масла, спреда) и помещают его в коническую колбу емкостью 150–200 мл. В другую колбу (контроль) наливают 2–3 мл воды. В обе колбы вносят по 10 мл хлороформа и растворяют жир. Затем в колбы добавляют по 20 мл ледяной уксусной кислоты и по 1 мл раствора йодистого калия. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 3 мин. Затем в колбы прибавляют по 1 мл 1 % раствора крахмала и выделившийся йод титруют 0,01 н раствором тиосульфата натрия до исчезновения синей окраски.

Вычисление результатов проводят по формуле:

69

где X — перекисное число;

а — количество 0,01 н раствора гипосульфита, израсходованное на титрование йода, выделившегося в результате реакции жира с йодистым калием, мл;

b — количество 0,01 н раствора гипосульфита, израсходованное

вконтрольном определении, мл;

Т— поправка к титру раствора гипосульфита; Н — навеска жира; 0,001269 — титр 0,01 н раствора гипосульфита.

Опыт 4. Определение кислотного числа жиров

Оборудование и реактивы: весы аналитические, колба коническая на 100 мл, цилиндры мерные на 10 и 25 мл, пипетки на 1 или 2 мл, бюретка, масло растительное или жир животный, смесь спирта с диэтиловым эфиром (1 : 1), 0,1 н раствор NaOH в 96 % этиловом спирте.

Кислотное число характеризует кислотность жира и измеряется числом мг гидроксида калия, необходимого для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Кислотное число с другими физико-химическими показателями характеризует качество масла. Масло, полученное из зрелых семян, характеризуется малым содержанием свободных жирных кислот. В масле же из незрелых семян содержание свободных жирных кислот значительно. При хранении масла наблюдается гидролиз глицеридов, который приводит к накоплению свободных жирных кислот, т. е. к

70