Основы биохимии. Динамическая биохимия. Практикум для СПО

Таблица 2

Определение инвертированного сахара по Бертрану, мг

Контрольные вопросы и задания

1.Объясните сущность описанного метода определения углеводов, приведя необходимые уравнения реакций.

2.По данным титрования вычислите содержание простых и сложных углеводов в повидле.

41

Лабораторная работа № 2.

Определение фруктозы по Кольтгофу

Цель работы — ознакомиться с перманганатометрическим методом определения фруктозы в биоматериале.

Оборудование и реактивы: фарфоровая ступка, коническая колба на 200 мл, водяная баня, воронка, фильтр, мерный цилиндр, 0,5 н раствор йода (6,35 г йода растворяют в концентрированном растворе, полученном из 10 г KI, растворенном в минимальном количестве воды, и доводят дистиллированной водой до 100 мл), 0,5 н раствор NaOH, 4 н раствор NaOH, 5 % и 10 % растворы H2SO4, 1 % раствор Na2SO3, реактив Фелинга, 10 % раствор Pb(CH3COO)2, метилоранж (50 мг растворить в 100 мл воды), хранить в темной склянке.

Метод заключается в предварительном разрушении альдоз и других редуцирующих веществ посредством настаивания с щелочным раствором йода и последующего определения по Бертрану фруктозы, остающейся без изменения в этих условиях. Метод Кольтгофа применяют в тех условиях, когда требуется знать не только общее содержание редуцирующих сахаров, но и раздельно глюкозу и фруктозу. Глюкозу вычисляют из разности между общим содержанием редуцирующих сахаров и количеством фруктозы.

Ход работы: навеска сырого растительного материала 10–25 г, в зависимости от содержания сахаров, растирается в фарфоровой ступке до однородной массы и количественно переносится в коническую колбу на 200 мл, заливают 150 мл горячей дистиллированной воды и нагревают 30–60 мин. на водяной бане при 75–80 ºС. Затем содержимое переносят в мерную колбу на 200 мл, несколько раз ополаскивая колбу.

42

При остывании вытяжки или охлаждении водопроводной водой осаждают белки прибавлением 2,5 мл 10 % раствора нейтрального Pb(CH3COO)2, объем доводят до метки дистиллированной водой и затем, тщательно перемешав содержимое, фильтруют вытяжку в другую колбу. Отбирают 25 мл вытяжки, в которой требуется определить содержание фруктозы, помещают в мерную колбу на 100 мл, приливают пипеткой 1–2 капли 0,5 н раствора I2, чтобы его хватило на разрушение альдоз, о примерном содержании которых судят по определению сахаров по Бертрану (до гидролиза), и полуторный объем (3– 4 капли) 0,5 н раствора NaOH по сравнению со взятым объемом йода. Оставляют при комнатной температуре на 10 мин. При этом раствор становится слабоокрашенным.

После некоторого времени раствор подкисляют 5 % серной кислотой (достаточно 1,3–1,5 мл). Выделившийся при этом избыток йода удаляют прибавлением 10 % раствора сульфита натрия (20 мл до значительного осветления раствора до молочной окраски, затем прибавлением 1 % раствора до обесцвечивания. Если после добавления серной кислоты йод не выделился, тогда опыт надо повторить, взяв больше йода или меньше вытяжки).

После обесцвечивания приливают 3 капли метилоранжа, нейтрализуют 4 н раствором NaOH и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Из полученного раствора (100 мл) берут пробы по 20 мл и обычным путем определяют сахара по Бертрану. Особенность определения фруктозы состоит в том, что растворы медного купороса и сегнетовой соли (реактив Фелинга) приливают обязательно одновременно, для чего их предварительно смешивают в отдельной колбе (по 20 мл каждого) и приливают смесь. В противном случае образуется труднорастворимый осадок. Для вычисления пользуются таблицей пересчета от мг меди к мг фруктозы (табл. 3).

43

Таблица 3

Определение фруктозы по меди, мг (по Кольтгофу)

Контрольные вопросы и задания

1.Объясните сущность описанного метода определения углеводов, приведя необходимые уравнения реакций.

2.Сделайте выводы о содержании фруктозы в исследуемом об-

разце.

3.Определите число оптических изомеров для альдопентоз.

4.Изобразите проекции Фишера всех линейных изомеров альдопентоз.

5.Определите число оптических изомеров у альдогексоз.

6.Изобразите проекции Фишера всех линейных изомеров альдогексоз.

7.Запишите формулы следующих веществ: D-глюкоза, D-галак- тоза, L-глюкоза.

44

Лабораторная работа № 3.

Микрометод количественного определения сахаров

в растениях по А. С. Шевцову и Э. Х Лукьянченко

Цель работы — ознакомиться с методом определения сахаров в растительном материале.

Оборудование и реактивы: фарфоровая ступка с пестиком, воронки, коническая колба на 50 мл, мерный пальчик, мерная колба на 25 мл, водяная баня, пробирки, раствор НСI (1 : 1), 0,4 н. раствор NaOH, раствор феррицианида (1,65 г K3Fe(CN)6 и Na2CO3 растворяют в 1 л воды, хранят в темной склянке), раствор Fe2(SO4)3 (1 г Fe2(SO4)3 растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты (плотностью 1,84 г/мл) и доводят в мерной колбе до 1 л), 10 % раствор желатина. В день анализа готовят рабочий раствор, смешивая растворы 3 и 4 в соотношении 20 : 1.

Глюкоза в данном методе окисляется до глюконовой кислоты, восстанавливая гексоциано(III)феррат калия в щелочной среде при нагревании в гексоциано(II)феррат калия. Последний, в свою очередь, образует с сульфатом железа (III) устойчивую синюю окраску (берлинская лазурь). Для предотвращения выпадения осадка в сульфат железа добавляется желатин:

3K4Fe(CN)6 + 2Fe2(SO4) → Fe4[Fe(CN)6]3 + 6K2SO4.

Достоверно определяется концентрация сахара от 0,01 до 0,1 мг/мл.

Ход работы: навеску 0,25 г свежего растительного материала растирают в ступке с водой и количественно переносят в колбу на 50 мл. Для осаждения белков прибавляют 10 % раствор сульфата цинка из расчета 1,5 мл на 1 г навески.

45

Далее добавляют 0,4 н раствор NaOH в 0,5 раза больше, чем раствора сульфата цинка, взбалтывают и доводят до метки дистиллированной водой. Фильтруют в сухую колбу. Первую порцию фильтрата (3–5 мл) отбрасывают.

Пипеткой отбирают 12,5 мл фильтрата и переносят в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл разведенной соляной кислоты (1 : 1). Колбы с содержимым ставят в горячую водяную баню при 70 ºС и выдерживают 10 мин. При этом происходит гидролиз сахарозы.

Раствор охлаждают, прибавляют каплю фенолфталеина, нейтрализуют 2 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания, перемешивают, доводят до метки.

В пробирки отбирают 2 мл вытяжки и 2 мл щелочного раствора гексоциано(III)феррата калия и 2 мл воды. Содержимое пробирок перемешивают и нагревают 15 мин. в кипящей водяной бане. Затем пробирки охлаждают и в каждую приливают по 2 мл раствора сульфата железа (III), перемешивают и доводят объем до 10 мл дистиллированной водой. Хорошо перемешивают. Измеряют оптическую плотность по отношению к раствору сравнения в кювете при красном светофильтре.

Вычисление результатов производят по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору глюкозы. Проводят перерасчет на 100 г растительного сырья.

Приготовление стандартного раствора. В мерную колбу вме-

стимостью 100 мл помещают 0,10 г стандартного образца глюкозы, растворяют в воде или насыщенном растворе бензойной кислоты в воде, доводят этим же раствором до метки и перемешивают. Отбирают 2,0 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Полученный раствор содержит 0,02 мг/мл глюкозы. Далее проводят анализ аналогично раствору испытуемого препарата.

46

Вместо использования одного стандартного раствора можно применять разведенные растворы стандартного образца глюкозы с концентрацией от 0,01 до 0,05 мг/мл.

Калибровочный график строят при каждом анализе. Содержание сахаров в 1 мл раствора испытуемого препарата

находят по калибровочной кривой зависимости оптической плотности калибровочных растворов от содержания стандартного образца глюкозы в 1 мл растворителя.

Примечание: приготовление раствора стандартного образца глюкозы можно проводить следующим образом. Около 0,05 г (точная навеска) глюкозы, предварительно высушенной при температуре 100–105 °С до постоянной массы, помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

1 мл раствора стандартного образца содержит около 0,2 мг глюкозы. Раствор должен быть свежеприготовленным.

Контрольные вопросы и задания

1.Постройте калибровочную кривую зависимости сахарозы от оптической плотности.

2.Сформулируйте выводы о содержании сахарозы в исследуемом продукте.

Лабораторная работа № 4.

Определение содержания крахмала

в пищевых продуктах

Цель работы — познакомиться с методом определения крахмала в биоматериале.

47

Оборудование и реактивы: мерная колба на 200 мл, колбы конические на 200 мл с обратным холодильником, ступки фарфоровые с пестиками, пипетки градуированные на 1, 5, 10 мл, пипетки Мора на 15, 25 мл, бюретка, стеклянные стаканы, мерный цилиндр на 100 мл, предметные стекла, стеклянные палочки, электроплитка, водяная баня, 2 % раствор HCl, 10 % раствор NaCl, 0,1 н раствор йодида калия, 0,1 н раствор тиосульфата натрия, 2 н раствор NaOH, 2 н раствор H2SO4, 1 % раствор крахмала, дистиллированная вода, крахмалсодержащие продукты (картофель, мука, злаки, чипсы и т. д.).

Ход работы: 1 г крахмалсодержащих продуктов измельчить и перетереть в фарфоровой ступке. В мерные колбы на 200 мл цилиндром отмерить по 50 мл холодной дистиллированной воды и перенести туда исследуемый продукт. Быстро влить в колбы по 100 мл горячей дистиллированной воды и сразу же поместить их в кипящую водяную баню на 1 ч., чтобы полностью перевести крахмал в раствор. Содержимое колб необходимо периодически перемешивать, при этом крахмальные зерна набухнут и распадутся. Затем колбы вынуть из бани, охладить до 40 ºС. Пипеткой прибавить к содержимому колб 10 мл раствора слюны и 5 мл 10 % раствора хлорида натрия для активации фермента амилазы слюны.

Для ферментативного гидролиза опустить колбы в водяную баню при 37–40 ºС на 1 ч. Степень гидролиза крахмала и момент его завершения устанавливается по реакции с йодом. Для этого стеклянной палочкой из колбы достают каплю жидкости с твердыми частицами, переносят пробу на предметное стекло и приливают несколько капель раствора йода в йодиде калия. Исчезновение синего окрашивания при действии йода на пробу свидетельствует об окончании гидролиза крахмала.

Колбу довести водой до метки, тщательно перемешать ее содержимое и отфильтровать в сухой стакан.

48

Образовавшиеся в результате действия амилазы декстрины и мальтозу гидролизовать 25 % раствором соляной кислоты. Для этого 100 мл фильтрата перенести в коническую колбу на 200 мл. Добавить 12 мл 25 % раствора соляной кислоты и выдержать колбу на кипящей водяной бане с обратным холодильником 1 ч. По окончании гидролиза коническую колбу охладить, раствор полностью перенести в мерную колбу на 200 мл, довести раствор до метки дистиллированной водой.

В полученном растворе определить содержание глюкозы йодометрией. Для этого в коническую колбу с помощью пипетки поместить 10 мл полученного раствора, 15 мл 0,1 н раствора йодида калия, затем медленно добавить 25 мл 0,5 н раствора гидроксида натрия (или 6-7 мл 2 н раствора) при энергичном помешивании до исчезновения окраски йода. Через 15 мин. в колбу прибавить 5 мл 2 н раствора серной кислоты и оттитровать выделившийся йод 0,1 н раствором тиосульфата натрия. Когда раствор станет соломенно-желтым, добавить пипеткой 1 мл 1 % раствора крахмала на каждые 50 мл жидкости.

Параллельно выполняется контрольный опыт, в котором вместо гидролизата берется такой же объем дистиллированной воды.

Содержание крахмала (г или %) в продукте рассчитывается по формуле:

где Х — содержание крахмала, г или %;

V — объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл;

V1 — объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование пробы, мл;

49

V2 — объем вытяжки из растительного материала, мл (в данном случае 400 мл);

0,009 — коэффициент пересчета результатов титрования на содержание глюкозы;

0,9 — коэффициент пересчета глюкозы в крахмал; Н — навеска исследуемого материала, г (в данном случае 100 г);

V3 — объем гидролизата, взятого для йодометрического определения глюкозы, мл (10 мл).

Контрольные вопросы и задания

1.Запишите уравнение гидролиза крахмала, подпишите промежуточные и конечные продукты реакции, их цвет в реакции с йодом.

2.Сформулируйте выводы о содержании крахмала в исследуемом растительном материале.

3.Сделайте вывод, почему ферментативный гидролиз идет при

37–40 ºС.

4.Подумайте, как определить содержание крахмала в продуктах питания. Для чего это нужно знать?

5.Сравните содержание крахмала в чипсах разных производителей. Сделайте выводы.

Лабораторная работа № 5.

Определение клетчатки по методу Кюршнера и Хафера

в модификации А. И. Ермакова

Цель работы — познакомиться с модификацией метода определения клетчатки в биоматериале.

Метод основан на окислительном разрушении и растворении различных соединений, входящих в состав растений (в том числе со-

50