Основы биохимии. Динамическая биохимия. Практикум для СПО

Содержимое пробирки перемешивают и через 5 мин. центрифугируют в течение 10 мин. при скорости 3000 об/мин. Содержимое пробирок перемешивают. Через 30 мин. определяют оптическую плотность стандартной и опытной проб при длине волны 640 нм (590–700 нм, красный светофильтр) против контрольной пробы в 10 мм кювете. Окраска является стабильной в течение 30 мин. Расчет содержания мочевой кислоты проводят по формуле:

где С — содержание мочевой кислоты в исследуемой пробе, мкмоль/л;

Аиссл. — оптическая плотность исследуемой пробы; Астанд. — оптическая плотность стандартной пробы;

30 — содержание мочевой кислоты в стандартном растворе, мкмоль/л;

10 — величина разведения сыворотки.

У мужчин содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 240–500 мкмоль/л, у женщин — 160–400 мкмоль/л.

Контрольные вопросы и задания

Сделайте вывод о содержании мочевой кислоты в исследуемых биологических образцах.

21

2.4. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Лабораторная работа № 1.

Характеристика препаратов нуклеиновых кислот

Цель работы — ознакомиться с качественными реакциями, подтверждающими состав продуктов гидролиза.

Оборудование и реактивы: спектрофотометр, одноканальный дозатор, раствор ДНК.

Чистоту препаратов нуклеиновых кислот определяют по спектральной кривой поглощения в ультрафиолетовом свете и по величине отношений Е260 : Е230 и Е240 : Е280.

Ход работы: в спектрофотометрическую кювету налить 3 мл раствора ДНК (0,003 %) и на спектрофотометре измерить оптическую плотность (D) при длинах волн: 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 нм.

На основе полученных данных построить график зависимости D (ДНК) от длины волны. Найти по графику максимум поглощения в ультрафиолетовом свете препарата ДНК. Затем вычислить отношение Е260 : Е230 и Е240 : Е280. Для препаратов нуклеиновых кислот, достаточно хорошо очищенных от белков и полисахаридов, эти показатели должны быть в пределах 2,1–2,4.

Контрольные вопросы и задания

Сделайте вывод о чистоте исследованного препарата ДНК.

22

Лабораторная работа № 2.

Количественное определение ДНК

Цель работы — провести количественное определение содержания ДНК в исследуемых препаратах.

Оборудование и реактивы: спектрофотометр, одноканальный дозатор, водяная баня, раствор ДНК, дифениламиновый реактив (1 г дифениламина в 100 мл CН3COOH лед. + 2,75 мл Н2SO4 конц.).

Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорционально концентрации ДНК.

Ход работы: сначала необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пронумерованные пробирки налить по 1 мл раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2 мл дифениламинового реактива. Поместить пробирки на 10–15 мин. в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определить оптическую плотность каждого раствора. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат — соответствующие им значения оптической плотности.

Далее берут 2 пробирки: в первую (контрольная проба) наливают 1 мл воды, в другую (опытный вариант) — 1 мл водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10– 15 мин. в кипящую водяную баню. Затем пробы остужают и измеряют насыщенность окраски относительно контроля при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.

23

Контрольные вопросы и задания

Сделайте ввод о количественном содержании ДНК в различных препаратах.

Литература:

1.Большой практикум «Биохимия» : лабораторные работы : учебное пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению «Биология» / составители : М. Г. Кусакина, В. И. Суворов, Л. А. Чудинова. — Пермь : Пермский гос. нац. исслед.

ун-т, 2012. — 147 с.

2.Комов, В. П. Биохимия : учебник для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 655500 «Биотехнология» / В. П. Комов, В. Н. Шведова. — 2-е изд., испр. — Москва :

Дрофа, 2006. — 639 с.

3.Методическое руководство для практикума по биохимии : учебно-методическое руководство / Н. С. Сиянова, Т. А. Невзорова, С. Н. Неуструева. — Казань : КГУ, 2008. — 46 с.

4.Филиппович, Ю. Б. Практикум по общей биохимии : учебное пособие для хим. спец. пед. ин-тов / Ю. Б. Филиппович, Т. А. Егорова, Г. А. Севастьянова ; под общей редакцией Ю. Б. Филипповича. — 2-е изд., перераб. — Москва : Просвещение, 1982. — 311 с.

24

3. БЕЛКИ И БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН

Белки — это высокомолекулярные биополимеры, структурную основу которых составляют полипептидные цепи, построенные из аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидной связью.

Обмен белка занимает центральное место среди многообразных процессов метаболизма, свойственных живой материи. Все другие виды обмена — углеводный, липидный, нуклеиновый, минеральный — обслуживают обмен белков, специфический биосинтез белка. Белковый обмен весьма строго специфичен, обеспечивая непрерывность воспроизводства и обновления белковых тел организма.

Именно белковый обмен координирует, регулирует и интегрирует многообразие химических превращений в целостном живом организме, подчиняя его сохранению вида, непрерывности жизни. По сравнению с другими видами обмена веществ обмен белка имеет ряд особенностей.

Одной из характерных особенностей белкового обмена является его чрезвычайная разветвленность. В превращениях 20 аминокислот белковой молекулы в организме животных участвуют несколько сотен промежуточных продуктов, тесно связанных с метаболитами обмена углеводов и липидов. Блокирование какого-либо специфического пути обмена даже одной аминокислоты может привести к появлению совершенно неизвестных продуктов.

Состояние белкового обмена определяется множеством факторов, как экзогенных, так и эндогенных. Большое значение при этом играет биологическая полноценность белков пищи (или корма для животных). Любые отклонения от нормального физиологического состояния организма, нарушения в обмене углеводов, липидов и др. незамедлительно отражаются на азотистом обмене.

25

Состояние обмена белка в живом организме можно характеризовать балансом азота. Этот термин означает количественную разницу между введением с пищей азота и выведением его в виде конечных продуктов азотистого обмена, выраженных в одинаковых единицах. Поскольку основная масса азота пищи представлена белками и большинство выделяемых конечных азотистых продуктов является следствием распада белка, принято считать, что для правильной оценки состояния обмена белков достаточно точным критерием может быть определение азотистого баланса. Различают 3 вида азотистого баланса организма: положительный, нулевой (азотистое равновесие) и отрицательный.

3.1. АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА

Лабораторная работа № 1.

Конечные продукты белкового обмена

Цель работы — провести качественное определение продуктов белкового обмена.

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, водяная баня, ступка с пестиком, воронка, фильтры бумажные «Белая лента», 0,1 %, 5 % раствор мочевины, гипобромуксусная кислота (ледяная), ксантгидрол (насыщ.) в метилате натрия, 20 % раствор сульфосалициловой кислоты, 10 % раствор HCl, 20 % раствор NaOH, пикриновая кислота (насыщ.).

26

Опыт 1. Разложение мочевины

под действием гипобромита натрия

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетка, 5 % раствор мочевины, раствор NaBrO.

Ход работы: к 2–3 мл 5 % раствора мочевины приливают 1 мл свежеприготовленного раствора гипобромита натрия. При этом мочевина разлагается по следующей схеме:

Эта реакция используется для количественного определения мочевины в моче.

Опыт 2. Реакция мочевины с ксантгидролом

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, водяная баня, 0,1 % раствор мочевины, CH3COOH (ледяная), ксантгидрол (насыщ.) в метаноле.

Ход работы: к 1 мл 0,1 % раствора мочевины прибавляют 2 мл CH3COOH (ледяной) и 0,5 мл насыщенного раствора ксантгидрола в метаноле. После перемешивания и стояния в течение некоторого времени выпадают кристаллы диксантилмочевины:

Данная реакция также используется для количественного определения мочевины.

27

Опыт 3. Открытие креатина в мышечной ткани

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, водяная баня, ступка с пестиком, стеклянная палочка, воронка, фильтр «Белая лента», измельченные мышцы, 20 % раствор NaOH, 20 % раствор сульфосалициловой кислоты (C7H6O6S), 10 % раствор HCl.

При нагревании на водяной бане креатин переходит в креатинин. Последний взаимодействует с ациформой пикриновой кислоты, образуя с нею соль — пикрат креатинина, окрашенную в яркооранжевый цвет:

Ход работы: мелко нарезанные мышцы растирают в ступке с пятью объемами дистиллированной воды. Полученную кашицу (2– 3 мл) переносят в пробирку и осаждают белки равным объемом 20 % раствором сульфосалициловой кислоты. Через несколько минут образовавшийся осадок отфильтровывают. Далее небольшой объем фильтрата переносят в пробирку, добавляют равный объем 10 % раствора HCl и нагревают на водяной бане в течение 2 ч. Затем прибавляют в извлеченную из бани пробирку 1–2 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 2 мл 20 % раствора NaOH.

28

Контрольные вопросы и задания

1.Запишите уравнения представленных качественных реакций на составные компоненты нуклеиновых кислот.

2.Реакции подтвердите цветными рисунками.

3.Сделайте вывод о проделанных реакциях.

3.2.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

ИИХ КОМПОНЕНТОВ

Лабораторная работа № 1.

Количественное определение белка по методу Лоури

Цель работы — освоить метод количественного определения содержания белка в различных продуктах.

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетки, ФЭК, 2 % раствор Na2CO3 в 0,1 н NaOH, 0,5 % раствор CuSO4·5H2O в 1 % растворе виннокислого среднего Na, К.

Метод основан на измерении интенсивности окраски, которую дает раствор белка в цветных реакциях — биуретовой и реакции Фолина. Метод высокочувствительный, но малоспецифичный, так как с реактивом Фолина дают реакцию свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу.

При взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса образуются комплексные соединения (биуретовая реакция), которые своими тирозиновыми и цистеиновыми радикалами восстанавливают смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот с образованием комплексного соединения синего цвета (реакция Фолина). Интенсивность окраски комплекса, которая зависит от

29

количества белка в исследуемой пробе, измеряется на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.

В работе используются следующие реактивы:

−А — 2 % раствор Na2CO3 в 0,1 н NaOH;

−В — 0,5 % раствор CuSO4·5H2O в 1 % растворе виннокислого среднего Na, К;

−С — щелочной раствор меди, полученный сливанием 50 мл реактива А и 1 мл реактива В (в день определения);

−D — реактив Фолина (приготовленный разводят в 2 раза). Чтобы определить содержание белка в исследуемой пробе,

необходимо построить калибровочную кривую (зависимость интенсивности окраски комплекса от количества белка). Для построения калибровочной кривой используют ряд растворов сывороточного альбумина с известными концентрациями. Для этого сначала готовят исходный раствор с концентрацией белка 0,5 мг в 1 мл, растворяя 5 мг альбумина в 10 мл дистиллированной воды. Затем из этого раствора готовят разбавленные растворы, наливая в пробирки № 1–6 указанное в таблице 4 количество исходного раствора белка и воды.

Ход работы: в восьми пронумерованных пробирках готовят смеси из раствора белка и воды (табл. 1). Содержимое пробирок встряхивают и в каждую пробирку добавляют 5 мл реактива С. Смесь тщательно перемешивают и через 10 мин. приливают к ней 0,5 мл раствора D. Снова перемешивают. Пробирки помещают в темноту. Через 30 мин. измеряют оптическую плотность каждого раствора на ФЭКе с красным светофильтром относительно контроля (пробирка № 7, в которую также добавляют все указанные выше реактивы). Строят калибровочную кривую, откладывая по горизонтальной оси (абсцисс) концентрации растворов белка, а по вертикальной оси (ординат) — соответствующие им значения оптической плотности.

30