Основы биохимии. Динамическая биохимия. Практикум для СПО

Таблица 1

Приготовление разбавленных растворов

Содержание белка в испытуемом растворе устанавливают по калибровочной кривой, которую готовят заранее по раствору белка точной известной концентрации. Для этого готовят серию растворов белка (лучше того белка, определение которого осуществляют) с содержанием от 20 до 400 мкг в 1 мл. Белок при этом растворяют в 0,1 н растворе едкого натра. Серию растворов готовят путем разведения исходного самого концентрированного раствора белка (400 мкг в 1 мл) до необходимых значений.

Полученные данные откладывают на графике. Соединяя серию точек одной линией, строят калибровочную кривую (рис. 1).

Аналогично можно провести определение содержания белка в других веществах (белке мяса, молока, желатина).

31

«Белая лента», сыворотка крови, 0,04 н раствор СН3СООН, 1 % водный раствор нингидрина.

Количество аминного азота определяется колориметрическим методом по интенсивности окраски комплекса, который образуется при взаимодействии аминогрупп с нингидриновым реактивом.

Ход работы:

1.Осаждение белков: в центрифужные пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови и 0,5 мл 0,04 н раствора СН3СООН, пробирки закрывают пробками и помещают их в холодную водяную баню. Воду в бане доводят до кипения. Образцы кипятят в течение 5 мин. (с начала кипения воды). Затем пробирки охлаждают до 38 °С.

2.Фильтрация: к содержимому пробирок добавляют по 1 мл дистиллированной воды, перемешивают и фильтруют раствор в мерную пробирку на 10 мл. Центрифужную пробирку и фильтр смывают еще 2 раза, каждый раз по 1 мл дистиллированной воды.

3.Реакция с нингидрином: к фильтрату добавляют 0,5 мл раствора нингидрина. Содержимое пробирок перемешивают и проводят инкубацию в водяной бане, кипящей в течение 20 мин. После инкубации пробирки охлаждают в холодной воде. Далее остужают 5 мин. при комнатной температуре, доводят дистиллированной водой до 10 мл. Параллельно ставят контрольную и стандартную пробы. В пробирку с контрольной пробой приливают 3 мл дистиллированной воды, а в пробирку со стандартной — 3 мл стандартного раствора аланина. Затем в обе пробирки добавляют 0,5 мл 04 н раствора СН3СООН и 0,5 мл раствора нингидрина, после перемешивания кипятят 20 мин. Далее контрольные образцы обрабатывают как исследуемые.

4.Колориметрия: плотность образцов измеряют на ФЭКе при зеленом светофильтре (540 нм) в 5 мм кювете. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольного образца и воды.

33

Расчеты проводят по формуле с использованием полученных данных экстинкции исследовательской и стандартной проб:

где ЕДОС и ЕСТ — значение экстинкций исследуемой и стандартной проб;

СДОС — количество мкг N (азота) в исследуемом растворе;

ССТ — количество мкг N (азота) в 0,5 мл стандартного раствора аланина. Стандартный раствор аланина с концентрацией 12,86 мг/ 100 мл содержит 64 мкг аланина в 0,5 мл. Молекулярный вес аланина — 90 Да, одна молекула аминокислоты содержит 1 атом азота (14 Да). По соотношению 90/14 = 6,4 можно определить, что 64 мкг аланина содержат 10 мкг азота.

0,5 мл стандартного раствора аланина обрабатывают так же, как сыворотку крови. Для перевода результатов в г/л количество мкг азота умножают на 2000 (для перечисления мкг азота на 1 л биологической жидкости) и делят на 106 (для перевода мкг в г). Итак, если использовалось 0,5 мл сыворотки крови, то конечная формула имеет следующий вид:

Х г/л = СИС 0,002

или (4)

Х г/л = СИС / 500,

где Х — количество азота в сыворотке крови, г/л; СИС — количество азота (мкг) в 0,5 мл сыворотки крови.

34

В норме концентрация азота в сыворотке крови составляет

0,020–0,050 г/л.

Контрольные вопросы и задания

1.Перечислите конечные продукты разложения белков и опишите пути их образования.

2.Назовите небелковые азотистые соединения крови и их биологическое значение.

3.Раскройте биологическое и клинико-диагностическое значение определения аминного азота.

4.Подумайте, в чем заключается принцип метода определения количества аминного азота.

5.Опишите последовательность определения аминного азота в биологических жидкостях.

Литература:

1.Болдырева, О. И. Методы исследования пищевых продуктов : методические указания к лабораторным работам / О. И. Болдырева, Е. М. Мозгунова. — Оренбург : ОГУ, 2012. — 70 с.

2.Большой практикум «Биохимия» : лабораторные работы : учебное пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению «Биология» / составители : М. Г. Кусакина, В. И. Суворов, Л. А. Чудинова. — Пермь : Пермский гос. нац. исслед.

ун-т, 2012. — 147 с.

3.Методическое руководство для практикума по биохимии : учебно-методическое руководство / Н. С. Сиянова, Т. А. Невзорова, С. Н. Неуструева. — Казань : КГУ, 2008. — 46 с.

35

4.Ушакова, Г. О. Лабораторный практикум к учебной дисциплине «Биохимия» / Г. А. Ушакова, О. А. Дёмшина. — Днепропетровск : Полиграфический издат. центр «Арбуз», 2015. — 61 с.

5.Филиппович, Ю. Б. Практикум по общей биохимии : учебное пособие для хим. спец. пед. ин-тов / Ю. Б. Филиппович, Т. А. Егорова, Г. А. Севастьянова ; под общей редакцией Ю. Б. Филипповича. — 2-е изд., перераб. — Москва : Просвещение, 1982. — 311 с.

6.Якупов, Т. Р. Биохимия : учебное пособие / Т. Р. Якупов. — Казань : КГАВМ им. Баумана, 2015. — 108 с.

36

4.УГЛЕВОДЫ И УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН

4.1.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ

Лабораторная работа № 1.

Определение водорастворимых углеводов по методу Бертрана

Цель работы — ознакомиться с количественным определением простых и сложных сахаров в продуктах питания.

Оборудование и реактивы: мерные колбы на 100 и 250 мл, ко-

нические колбы на 250 мл, пипетка на 10 мл, 20 мл, мерный цилиндр на 50 мл, часовое стекло для покрывания конической колбы, стеклянная палочка, воронка, бюретка, фильтровальная бумага, повидло, щелочной раствор сегнетовой соли для приготовления жидкости Фелинга (смешать раствор 173 г сегнетовой соли в 400 мл воды с раствором едкого натра в 100 мл воды), 10 % растворы уксуснокислого свинца и сернокислого натрия, сернокислое окисное железо, H2SO4 (конц.), 0,1 н раствор марганцовокислого калия, 25 % раствор HCl, 20 % рас-

твор NaOH.

Раствор сернокислого окисного железа можно готовить следующим образом: 50 г Fe (SO ) и 200 г (100 мл) концентрированной серной кислоты развести в 500 мл дистиллированной воды, к полученному раствору долить воды до объема 1 л. Надо проверить, нет ли в приготовленном растворе закисных соединений, способных окисляться марганцовокислым калием. Для этого к 20–30 мл раствора прилить 1 каплю 0,1 н раствора KMnO . Если проявится не исчезающая 10–20 сек. розовая окраска, раствор годен к употреблению. Если же капля обесцветится, то ко всему раствору добавить по каплям

37

0,1 н раствора KMnO до появления не исчезающей 10–20 сек. слабой розовой окраски.

Метод основан на способности редуцирующих сахаров, обладающих свободной карбонильной группой, восстанавливать в щелочном растворе окисную медь в закисную. Реакция протекает количественно. Сахароза и другие олигосахара, у которых связаны обе карбоксильные группы (сахароза) и одна мальтоза, требуют предварительного гидролиза кислотой и ферментом. Задача заключается в том, чтобы определить количество образовавшегося осадка закиси меди, которое строго соответствует количеству сахара, находящемуся в растворе. Для этой цели осадок закиси меди растворяют сернокислым окисным железом в присутствии серной кислоты, при этом закись меди количественно окисляется окисным железом, восстанавливая его в закисное, а последнее, в свою очередь, также количественно окисляется марганцевокислым калием. При этом протекают следующие реакции:

CuSO4 + 2 NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4.

В присутствии сегнетовой соли в щелочной среде гидрат окиси меди в осадок не выпадает, так как образуется комплексное соединение:

Фелингова жидкость окисляет альдегидные и кетонные группы. При взаимодействии раствора сахара с фелинговой жидкостью сахар окисляется и образует закись меди:

38

личество фильтрата кипятить 3 мин. с 40 мл жидкости Фелинга. Закись меди отфильтровать через гладкий, хорошо пригнанный к воронке фильтр. Осадок и стакан промыть горячей водой до появления бесцветных промывных вод. Подставить под воронку коническую колбу, в которой производилось восстановление жидкости Фелинга, а на фильтр вылить 30 мл раствора сернокислого окисного железа. Фильтр 2–3 раза промыть холодной водой. Фильтрат оттитровать 0,1 н раствором марганцовокислого калия до появления не исчезающего в течение 10–20 сек. розового окрашивания.

Для определения суммы простых и сложных сахаров взять 10 мл фильтрата, разбавить равным объемом воды, прилить к нему 2 мл 25 % раствора соляной кислоты. Закрыв колбу часовым стеклом, поставить ее на 2 ч. на кипящую водяную баню. Охладить раствор и нейтрализовать его 20 % раствором NaOH. Необходимое для этого количество щелочи лучше всего установить следующим опытом: 2 мл 25 % раствора HCl, 20 мл воды и нейтрализовать учитываемым количеством 20 % раствора NaOH по индикатору, например метилоранжу. После нейтрализации раствора добавить к нему 40 мл жидкости Фелинга, закончить анализ тем же путем, как и определение простых сахаров по количеству сахара в пересчете на глюкозу (табл. 2).

При расчете простых и сложных сахаров следует учесть, что 1 мл 0,1 н раствора KMnO соответствует 6,36 мг меди.

40