Основы биохимии. Динамическая биохимия. Практикум для СПО

−цель работы;

−номер и название опыта;

−краткое описание хода работы с указанием условий проведения опыта;

−рисунки и схемы используемых приборов;

−наблюдения;

−уравнения протекающих реакций;

−расчеты, таблицы, графики;

−выводы.

3. Тетрадь с лабораторными записями нужно вести чисто

иаккуратно, записи должны быть лаконичными.

4.Отчет о проведенной работе проверяет и подписывает преподаватель.

5.К сдаче зачета по лабораторному практикуму допускаются студенты, выполнившие и подписавшие у преподавателя все лабораторные работы.

6.Студенты, получившие зачет по лабораторному практикуму, допускаются к сдаче экзамена по курсу биологической химии.

11

2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ОБМЕН

Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные соединения — полинуклеотиды. Нуклеотиды содержат пуриновое (аденин или гуанин) или пиримидиновое (цитозин, тимин или урацил) основание, углевод (рибозу или дезоксирибозу) и фосфорную кислоту.

Различают два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибонуклеиновые кислоты) и РНК (рибонуклеиновые кислоты). Различие в углеводных компонентах: в ДНК — дезоксирибоза, в РНК — рибоза, а также в том, что в ДНК содержится тимин, а в РНК — урацил вместо тимина.

Нуклеиновые кислоты имеют очень важное значение в процессах жизнедеятельности организмов на всех стадиях развития. Их биологическая функция заключается в хранении, передаче и реализации генетической информации, обеспечивая тем самым жизнедеятельность и индивидуальность живого организма.

2.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Лабораторная работа № 1.

Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот

Цель работы — изучить основные физико-химические свойства нуклеиновых частей.

Для изучения химического состава нуклеиновых кислот проводят кислотный гидролиз дрожжей, богатых нуклеопротеинами (сложными белками, небелковым компонентом которых являются нуклеи-

12

новые кислоты), и в полученном гидролизате выявляют компоненты этих кислот при помощи следующих качественных реакций.

Опыт 1. Проба на пуриновые основания

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетка, гидролизат дрожжей, 10 % раствор NaOH, 1 % раствор AgNO3.

Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований, окрашенных в светло-коричневый цвет.

Ход работы: в пробирку вносят 0,5 мл гидролизата дрожжей, добавляют 2 мл 10 % раствора NaOH и 10 капель 1 % раствора AgNO3. Через несколько минут выпадает осадок серебряных производных пуриновых оснований.

Опыт 2. Реакция на дезоксирибозу

и рибозу с дифениламином

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетка, водяная баня, гидролизат дрожжей, 1 % раствор дифениламина.

Дифениламин с дезоксирибозой дает синее окрашивание, а с рибозой — зеленое. При нагревании дезоксирибозы в кислой среде образуются фурфурол, оксилевулиновый альдегид и сходные хромоге-

13

ны, которые, конденсируясь с дифениламином, образуют соединения, окрашенные в синий цвет.

Ход работы: к 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 20 капель 1 % раствора дифениламина и кипятят на водяной бане в течение 15 мин. Появляется сине-зеленое окрашивание.

Проделать реакцию, заменив гидролизат дрожжей растворами ДНК и РНК.

Опыт 3. Реакция на рибозу с орцином

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетка, спиртовка, держатель, гидролизат дрожжей, раствор орцина, HCl

(конц.).

Рибозу можно обнаружить по реакции с орцином. При нагревании с соляной кислотой рибоза дегидратируется и превращается в фурфурол, который конденсируется с орцином с образованием соединения, окрашенного в зелёный цвет. Дезоксирибоза не дает этой реакции.

Ход работы: к 1 мл раствора орцина добавляют 0,5 мл гидролизата дрожжей, 1 мл HCl (конц.) и нагревают до кипения. Появляется зеленое окрашивание.

Проделать реакцию с растворами РНК и ДНК. Сравнить полученные результаты.

14

Опыт 4. Молибденовая проба

на фосфорную кислоту

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетка, водяная баня, гидролизат дрожжей, раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте.

Фосфорную кислоту обнаруживают по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется молибдатофосфат аммония:

Н3РО4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3PO4 12MoO3 +21NH4NO3 + 12Н2О

Ход работы: к 0,5 мл гидролизата дрожжей добавляют 10 капель молибденового реактива (раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте) и кипятят. При этом жидкость окрашивается в ли- монно-желтый цвет (не осадок). Охлаждают пробирку под краном, выпадает лимонно-желтый осадок молибдатофосфата аммония.

Контрольные вопросы и задания

1.Запишите уравнения представленных качественных реакций на составные компоненты нуклеиновых кислот.

2.Реакции подтвердите цветными рисунками.

3.Сделайте вывод о проделанных реакциях.

15

2.2. АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ НУКЛЕИНОВОГО ОБМЕНА

Лабораторная работа № 1.

Определение активности рибонуклеазы (КФ 2.7.7.16) спектрофотометрическим методом

Цель работы — ознакомиться с методикой определения рибонуклеазы в дрожжевом экстракте.

Оборудование и реактивы: центрифуга, термостат, пипетка на 1 мл, пробирки, раствор предварительно очищенной дрожжевой РНК (1 мг/мл) в ацетате натрия (0,1 М), 0,2 % водный раствор панкреатической РНК-азы, спиртово-магниевый осадитель (80 % этанол, содержащий 0,02 М MgCl2 в 1 л). Указанные реактивы готовят непосредственно перед работой.

Приготовление раствора РНК: навеску 5 г РНК растворяют в 50 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,2) и диазолируют в течение ночи на холоде против этого буферного раствора. Затем РНК осаждают двойным объемом 96 % спирта и осадок отделяют центрифугированием в течение 45 мин. при 1800 g. Полученный осадок РНК промывают 96 % спиртом и эфиром и высушивают в эксикаторе.

Данный метод основан на том, что под действием рибонуклеазы происходит расщепление полимерной молекулы РНК с образованием низкомолекулярных продуктов (моно- и олигонуклеотидов), количественное определение которых проводят спектрофотометрически при 260 нм (максимум поглощения нуклеотидов) после осаждения из реакционной смеси «неразложенной» РНК с помощью спиртовомагниевого осадителя.

Ход работы: в центрифужную пробирку вносят 0,4 мл раствора дрожжевой РНК и 0,2 мл водного раствора РНК-азы, перемешивают и

16

ставят в термостат при 37 °С на 30–60 мин. По истечении указанного времени реакцию останавливают, добавляя к пробе 1 мл спиртовомагниевого осадителя, и пробирку помещают на 1 ч. в ледяную баню. Образовавшийся в пробирке осадок РНК удаляют центрифугированием (8000 g, 2 мин., при охлаждении). Из центрифугата отбирают пробы по 0,5 мл, прибавляют к каждой по 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре против дистиллированной воды.

Параллельно обрабатывают контрольную пробу, в которую осадитель вносят до прибавления соответствующего ферментативного раствора.

Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контрольной (∆ Е260) служит показателем активности РНК-азы и используется для расчета активности фермента по формуле:

А , (1)

где А — активность фермента; ∆Е260 — прирост экстинкции опытной пробы по отношению к

контрольной;

V1 — объем после разбавления;

V2 — объем пробы после осаждения РНК спиртово-магниевым раствором;

V3 — объем пробы, взятой для разбавления; t — время инкубации, мин.;

W — масса белка (фермента) в пробе, мг.

Вместо раствора РНК-азы можно использовать слюну, разбавленную в 10 раз, кровь животных и гемолимфу насекомых, разбавленную в 100 раз, 5 % водные гомогенаты ткани объемом 0,5 мл.

17

Контрольные вопросы и задания

Сделайте вывод о количественном содержании фермента рибонуклеазы и ее активности в нуклеиновом обмене.

2.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ

Лабораторная работа № 1.

Определение содержания мочевой кислоты титрованием раствором гексациано-(III)-феррата калия

Цель работы — определить количество мочевой кислоты в биологических жидкостях.

Оборудование и реактивы: центрифуга, колбы конические на 50 мл, бюретка, пипетки на 1, 2,5 и 10 мл, 20 % раствор трихлоруксусной кислоты, 20 % раствор карбоната натрия, фосфорновольфрамовый реактив, стандартный раствор мочевой кислоты, раствор гексациано-(III)-феррат калия, кровь, гемолимфа насекомых, экстракты тканей животных, моча.

Приготовление реактивов:

–гексациано-(III)-феррат калия: 1 г соли и 1 г гидроксида натрия растворяют в 50 мл дистиллированной воды;

–фосфорно-вольфрамовый реактив: 10 г вольфрамата натрия, 8 мл 85 % фосфорной кислоты, 90 мл дистиллированной воды кипятят

втечение 2 ч. в колбе с обратным воздушным холодильником. После охлаждения доводят объем до 100 мл дистиллированной водой;

–стандартный раствор мочевой кислоты: 100 мл чистой, хорошо высушенной в эксикаторе мочевой кислоты заливают раствором, содержащим 200 мг гидрофосфата натрия и 400 г дигидрофосфата

18

натрия. Смесь подогревают до растворения солей и по охлаждении доводят дистиллированной водой до 200 мл.

Определение мочевой кислоты основано на ее способности восстанавливать фосфорно-вольфрамовый реактив в фосфорно-вольфра- мовую синь. Количество фосфорно-вольфрамовой сини определяют путем титрования гексациано-(III)-ферратом калия. По этому методу мочевую кислоту можно определять в образцах, не содержащих белка.

Ход работы: в работе используют безбелковый образец. Для этого к 5 мл биологической жидкости прибавляют равный объем 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают, осадок белков отделяют центрифугированием (3000 g, 10–15 мин.). К 5 мл безбелкового супернатанта приливают 2 мл фосфорно-вольфрамового реактива и 10 мл 20 % раствора карбоната натрия. Смесь тщательно перемешивают. При этом появляется синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству мочевой кислоты. Из бюретки осторожно по каплям титруют данную пробу раствором гексациано- (III)-феррата калия до обесцвечивания.

Чтобы рассчитать содержание мочевой кислоты, необходимо знать, какое ее количество соответствует 1 мл гексациано-(III)- феррата калия. Для этого берут 0,5 мл стандартного раствора, содержащего 0,25 мг мочевой кислоты, смешивают его с 2 мл фосфорновольфрамового реактива и 5 мл 20 % раствора карбоната натрия.

Образовавшуюся после взбалтывания фосфорно-вольфрамовую синь титруют раствором гексациано-(III)-феррата калия до обесцвечивания. Если, например, на титрование стандартной пробы пошло 3,8 мл гексациано-(III)-феррата калия, то 1 мл его соответствует (0,25 : 3,8) 0,066 мг мочевой кислоты. Если на титрование опытной пробы пошло 1,5 мл раствора гексациано-(III)-феррата калия, то содержание мочевой кислоты в безбелковом образце (5 мл биологиче-

19

ской жидкости) будет равно 0,099 мг (0,066 × 1,5), а в 100 мл биологической жидкости — 3,96 мг (0,099 × 40)).

Контрольные вопросы и задания

1.Назовите пути образования мочевой кислоты в разных живых организмах.

2.Напишите структурную формулу мочевой кислоты.

3.Запишите принцип метода количественного определения мочевой кислоты.

Лабораторная работа № 2.

Спектрофотометрическое определение содержания

мочевой кислоты

Цель работы — определить количество мочевой кислоты в биологических жидкостях.

Оборудование и реактивы: сыворотка или плазма крови, 10 % раствор натрия дигидровольфрамат дигидрата, 10 % раствор натрия карбоната, 0,35 М раствора сульфатной кислоты, фосфатвольфрамовый реактив (реактив Фолина), 30 мкм раствор мочевой кислоты, пипетки, пробирки, центрифуга.

Мочевая кислота восстанавливает фосфат-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета, оптическая плотность которого при длине волны 640 нм пропорциональна концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови.

Ход работы: в центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови и 4 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают и добавляют 0,25 мл 0,35 М раствора сульфатной кислоты и 0,25 мл 10 % раствора натрия дигидровольфрамат дигидрата.

20