3.КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ПО ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

3.1.ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ - наука о химических методах изолирования, обнаружения и определения ядовитых и сильнодействующих веществ, а также продуктов их превращения в тканях, органах и жидкостях организма (животного, растения) и в окружающей человека среде и предметах (вода, воздух, земля, остатки пищевых продуктов, лекарств и т.п.)

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ

ХИМИЯ

ЦЕЛЬ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ: разработка новых и усо-

вершенствование применяемых методов выделения, обнаружения и количественного определения, ядовитых и сильнодействующих веществ, а также продуктов их превращения в тканях, органах и жидкостях организма (человека, животного, растения) и в окружающей человека среде и предметах (вода, воздух, земля, остатки пищевых продуктов, лекарств и т.п.).

9

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ:

1.Помощь следственным органам в решении, возникающих в практике их работы, вопросов, которые требуют наличия специальных познаний в области токсикологической химии.

2.Оказание помощи органам здравоохранения по предупреждению отравлений химическими веществами, используемыми в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и быту.

3.Помощь производству по предотвращению острых отравлений химическими веществами, используемыми в промышленности, или токсичными компонентами промышленных выбросов, а также в профилактике развитий профзаболеваний уработников производств.

Название предмета «Токсикологическая химия» уже само указывает, что это наука, связанна, с одной стороны, с токсикологией, с другой – с химией. Токсикология – наука медицинская. Ее название происходит от двух греческих слов: toxikon – яд и logos – учение. Токсикология, таким образом, является наукой о ядахи их действии наорганизм (человека, животного, растения).

Методы, используемые токсикологией:

10

Токсикологическая химия возникла из потребностей судебно-медицинской токсикологии, изучающей умышленные, случайные и другие отравления. Судебно-медицинская токсикология является одним из разделов судебной медицины. В период своего становления и развития токсикологическая химия была связана, главным образом, с судебно-медицинской токсикологией и называлась судебной химией.

Но с развитием химии, химической промышленности и фармации постоянно увеличивается число фармацевтических препаратов и веществ, применяемых в медицине и в различных отраслях народного хозяйства. Многие из этих веществ при определенных условиях могут вызывать отравления человека и животных. К их числу относится большинство лекарственных соединений (поэтому для определения отравлений этими веществами необходима химическая количественная оценка их содержания в организме). Некоторые вещества, входящие в состав выбросов промышленных предприятий, могут загрязнять окружающую среду, достигая в ней токсических концентраций. К примеру, источником отравлений могут стать сточные воды промышленных предприятий, загрязняющие водоемы, вода которых употребляется населением. Актуальным для ряда промышленных районов России является загрязнение поверхностного слоя почв и приземного слоя атмосферы.

В последние десятилетия число потенциально опасных токсических соединений постоянно увеличивается за счет широкого применения ядохимикатов (пестицидов) для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур. Некоторые применяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты (хлорорганические соединения – диоксины, полихлорбифенилы, ртутьорганические соединения и др.) способны накапливаться в продуктах растительного и животного происхождения, употребляемых населением в пищу. Ядохимикаты, смываемые с поверхности растений дождевыми водами, могут поступать в почву, а затем в водоемы и вызывать отравления.

Технология современных пищевых производств также предусматривает применение широко ассортимента химических добавок (консервантов,

11

актиоксидантов, красителей, пеногасителей, стабилизаторов, эмульгаторов, вкусовых и ароматизирующих соединений) которые не всегда являются безопасными для здоровья потребителя.

Нередко причиной отравлений становятся технические жидкости для обеспечения работы автомобилей и бытовые химикаты при неумелом обращении с ними.

Таким образом, в связи с развитием химической науки и внедрением новых соединений во все отрасли современной экономики, постоянно увеличивается число ядовитых веществ и объектов химико-токсикологического анализа и все более актуальной становится проблема химической безопасности человечества. Вследствие сложившейся ситуации для противостояния угрозе во всех странах мира постоянно увеличиваются объемы химико-токсикологических исследований, цель которых – обнаружение, идентификация и количественное определение ТВ, в том числе и новых.

Специализированные химико-токсикологические исследования проводят высококвалифицированные эксперты, работающие в области судебнохимических, клинико-токсикологических, экологических, криминалистических, антидопинговых экспертиз, а также в области профпатологии и клинической фармакологии.

Методы обнаружения, идентификации и количественного определения ТВ постоянно совершенствуются, как за счет модификаций старых известных аналитических методов исследований, так и внедрения новых: ГХ-МС, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС-ЯМР, ГЖХ-ИК-ФС (Фурье-спектрометрия), КЭ.

Основные разделы токсикологической химии:

1.Биохимическая токсикология, изучающая кинетику всасывания токсического вещества, распределения, выделения, механизм метаболических реакций и т.д.

2.Аналитическая токсикология, изучающая способы и методы химического анализа в приложении к биологическим и небиологическим объ-

12

ектам. Аналитическая токсикология является основным разделом токсикологической химии рассматривающим способы изолирования, обнаружения, идентификации и количественного определения токсических веществ в исследуемых объектах.

Понятие о ксенобиотиках или чужеродных веществах

Природные и синтетические вещества, не используемые как источники пищи и структурные компоненты тканей, но поступающие в организм человека (с пищей, водой, воздухом или другими путями) получили название

чужеродных соединений или ксенобиотиков.

Являясь чужеродными для нормальных метаболических путей и обладая зачастую в то же время биологической активностью, эти вещества могут изменять и нарушать нормальное течение обменных процессов. В условиях патологии подавление некоторых метаболических процессов может оказаться полезным для организма и обусловить выздоровление больного.

Организм обладает защитными биохимическими механизмами, которые способны в определенной мере нейтрализовать активность чужеродных соединений (дезинтоксикация, инактивация) и ускорить их выведение из организма. Дезинтоксикация, инактивация происходят главным образом в печени (частично в легких, желудочно-кишечном тракте, почках и коже).

В судьбе чужеродных веществ, поступивших тем или иным путем в организм (через желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, через кожу и др.), следует различать несколько этапов:

-всасывание (резорбция), транспорт через биологические мембраны;

-перенос скровью и распределение в тканях;

-связывание с белками;

-метаболизм (собственно биотрансформация);

-взаимодействие с рецепторами (определенными зонами биохимических субстратов);

-выведение из организма.

13

Патогенное воздействие чужеродных химических веществ, поступаю-

щих в организм с пищей, может проявляться как в общетоксическом действии, так и в неблагоприятном влиянии на пищеварение и усвоение питательных веществ, нарушении работы иммунной системы, канцерогенном, эмбриотоксическом и тератогенном эффектах, нарушениях функции воспроизводства, ускорении процессов старения.

Для эффективной профилактики заболеваний алиментарного происхождения необходимо знать источники и пути поступления в продукты питания важнейшихгрупп чужеродных соединений:

Ядом, или ядовитым веществом, в токсикологии условно называют такое химическое вещество (или соединение), которое, будучи введено в организм в малых количествах, и действуя нанего химически или физико-химически, при определенных условиях способнопривести к болезниили смерти.

14

Отравлением, или интоксикацией, в токсикологии называется нарушение функций организма под влиянием ядовитого вещества, что может привести к расстройствуздоровья или к смерти.

Токсическое действие химического вещества зависит от:

1.Его дозы (токсической);

2.Физическихи химических свойств;

3.Условий применения (путь введения, наличие и качествопищи в желудке);

4.Состояния организма(пол, возраст, болезнь, вес, генетические факторыи др.)

Токсичность – способность вещества вызывать нарушения физиологических функций организма, в результате чего возникают симптомы интоксикации (заболевания), апри тяжелыхпоражениях - его гибель.

Мерой токсичности является доза, достаточная для отравления живого организма. Токсичность ядовитых веществ обычно сравнивают сопоставлением доз, вызывающих летальность определенной частоты подопытных животных. Такие дозы обозначают символом ЛД50 (наименьшая летальная доза ядовитого вещества, вызывающая летальность 50% подопытных животных).

Ядовитые вещества по системе принятой в СССР (ГОСТ 12.1.005 – 88) подразделяются на четыре класса опасности:

–сильнодействующие ЛД50 = до 50 мг/кг живого веса;

–высокотоксичные ЛД50 = 50-200 мг/кг;

–среднетоксичные ЛД50 = 200-1000 мг/кг;

–малотоксичные ЛД50 = более 1000 мг/кг.

Классификация отравлений:

15

Химико-токсикологический анализ

Некоторые авторы отождествляют понятия «токсикологическая химия» и «химико-токсикологический анализ».

Химико-токсикологический анализ – это собой совокупность научно обоснованных методов, применяемых на практике для выделения, обнаружения и количественного определения токсическихвеществ.

Токсикологическая химия – это наука о химических превращениях токсических веществ и их метаболитов в организме, методах их выделения из объектов биологического происхождения, обнаружения и количественного определения. Основными разделами токсикологической химии являются биохимиче-

ская и аналитическаятоксикология.

Биохимическая токсикология изучает вопросы кинетики (рассмотрены в курсе фармакологии) и биотрансформации ЧС в организме (рассмотрены в курсе биохимии), а также вопросы токсикодинамики (рассмотрены в курсе токсикологии).

Аналитическая токсикология является главным и основным разделом токсикологической химии, в котором рассматриваются способы и методы хи- мико-токсикологического анализа.

Основным вопросом аналитической токсикологии является рассмотрение вопросов, связанных с подготовкой проб (объектов), включающих выделение (изолирование), очистку и концентрирование токсических соединений из разнообразных объектов химико-токсикологических исследований, а также правильное использование для качественного и количественного определения возможностей различных методов анализа, их рациональное сочетание.

На современном этапе развития токсикологической химии перед ней ставятся следующие задачи:

1. Разработка новых и усовершенствование уже применяемых методов и методик изолирования токсических веществ из объектов химикотоксикологического анализа.

16

2.Разработка более эффективных методов и методик очистки извлечений, получаемых из объектов химико-токсикологического анализа.

3.Внедрение в практику химико-токсикологического анализа новых чувствительных и методов и методик обнаружения токсическихвеществ.

4.Разработка и усовершенствование методов количественного определения токсических веществ.

5.Исследование особенностей метаболизма токсических веществ в организме и трупном материале и разработка способов анализа метаболитов.

Кспецифическим особенностям ХТА следует отнести необходимость изолирования (извлечения) малых количеств (от мкг до мг) искомых веществ из сравнительно большого количества объекта исследования. От выбора применяемых исследователем методов изолирования нередко зависит дальнейший ход химического анализа, и даже его результаты.

Под термином «изолирование» следует понимать процесс выделения искомого вещества из биоматериала, его очистку от эндогенных веществ и концентрирование в анализируемой пробе.

Следует условно выделить три главные проблемы выделения индивидуальных компонентов из живых организмов:

1.Исходный материал – биомасса, из которой предстоит выделить интересующее исследователя вещество, состоит из сотен и тысяч различных соединений. Разделение таких смесей по уровню сложности не имеет себе равных среди других химических дисциплин.

2.Необходимость при анализе манипулировать с очень маленькими количествами вещества – миллиграммами, микрограммами и меньшими. При выделении это связано с незначительным содержанием многих компонентов в исходной биомассе, а также в ряде случаев с ограниченным количеством биомассы.

3.Многие компоненты обладают низкой устойчивостью, и сложно выделить компонент в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность состоянии (например, белки и нуклеиновые кислоты).

17

Вбольшинстве случаев химику приходится работать со следовыми количествами вещества, как правило, не химически чистого, а находящегося в смеси с сопутствующими (соэкстрактивными, балластными) веществами, извлекающимися при изолировании, и оказывающими негативное влияние на результат анализа. Балластные вещества удаляют введением дополнительных методов очистки.

Особенности и приемы пробоподготовки:

К специфическим особенностям ХТА следует отнести необходимость изолирования (извлечения) малых количеств (от мкг до мг) искомых веществ из сравнительно большого количества объекта исследования. От выбора применяемых исследователем методов изолирования нередко зависит дальнейший ход химического анализа, и даже его результаты.

Под термином «изолирование» следует понимать процесс выделения искомого вещества из биоматериала, его очистку от эндогенных веществ и концентрирование в анализируемой пробе.

Вбольшинстве случаев химику приходится работать со следовыми количествами вещества, как правило, не химически чистого, а находящегося в смеси с сопутствующими (соэкстрактивными, балластными) веществами, извлекающимися при изолировании, и оказывающими негативное влияние на результат анализа. Балластные вещества удаляют введением дополнительных методов очистки.

На начальной стадии пробоподготовки желательно добиться разрушения целостности тканей и клеток, что способствует повышению эффективности экстракции. Измельчение образца проводят ножницами до 0,5 – 2 см3; растиранием в ступке с песком, стеклом, солями; с помощью гомогенизаторов; обработкой материалов ультразвуком.

Обезвоживание образца (лиофилизацию) проводят под вакуумом в эксикаторах с использованием безводного Na2SO4, CaSO4 или с помощью лиофильных сушек (сублимационное высушивание замороженногопри температуре -5 -15°С материала в вакууме).

Очистку от белков проводят осаждением этанолом (95%) или другими органическими растворителями (метанол, ацетонитрил, ацетон), кислотами (соляной,

18

хлорной, трихлоруксусной, вольфрамовой), солями (вольфраматами, сульфатами, нитратами, фосфатами, хлоридами).

Очистка от липидов обычно проводится экстракцией органическими растворителями, хроматографическими методами, сеперационными методами, вымораживанием.

Для определения неорганических веществ (группы «металлических ядов») применяют минерализацию биологической матрицы.

Вещества с низкими температурами кипения (группа «летучих ядов») изолируют методом дистилляции сводяным паром (парофазной экстракции).

Жидкость-жидкостная экстрация (ЖЖЭ) остается самым распростра-

ненным методом изолирования группы «нелетучих ядов», к которым относятся большинство лекарственных, наркотических и допинговых средств. В основе метода лежит распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкостями, которое зависит от природы самого исследуемого вещества и жидких фаз, а так же от рН, температуры и некоторых других факторов:

Рис. 1. Прибордля экстракции:

1. Делительная воронка; 2. Жидкость с большей плотностью; 3. Жидкость с меньшей плотностью; 4. Пробка; 5. Лапка; 6. Приемник извлекающий фракции; 7. Приемник исчерпывающей фазы.

19

В основе твердофазной экстракции лежит адсорбция компонентов анализируемой пробы на твердом сорбенте с последующим фракционным элюированием соответствующими растворителями:

Рис. 2. Схемаизображения последовательных стадий процесса разделения компонентов раствора матрицы напатроне для ТФЭ

ТФЭ-метод подобен колоночной хроматографии и основан на специфических взаимодействиях выделяемого компонента (или мешающих его определению компонентов матрицы) с сорбентом, находящимся в небольшом патроне ("Cartridge"). Патрон обычно состоит из инертной полиэтиленовой или полипропиленовой оболочки, внутри которой помещается сорбент, плотно и равномерно упакованный между двумя пористыми фильтрами.

В зависимости от свойств определяемых компонентов, их количества и концентрации, а также свойств раствора матрицы, может быть выбран один или несколько последовательно соединенных патронов с одинаковыми или различными сорбентами.

20

Особенности химико-токсикологического анализа (ХТА)

1.Чрезвычайное многообразие и разнохарактерность объектов исследования: биологические жидкости (кровь, моча), рвотные массы, внутренние органы, волосы, ногти, пищевые продукты, препараты бытовой химии, пестициды, образцы сельскохозяйственной продукции, предметы домашнего обихода, одежда, воды, почва, воздух.

2.Необходимость изолирования (извлечения) малых количеств (от мкг до мг) искомых химических веществ из сравнительно большого количества объекта исследования составляет главную особенность ХТА. От методов изолирования нередко зависит весь ход и результаты анализа.

3.В большинстве случаев химику-токсикологу приходится работать со следовыми количествами химического вещества, как правило, не химически чистого, а находящегося в смеси с сопутствующими веществами, которые могут оказать негативное влияние на результаты анализа. Эти балластные вещества удаляютсядополнительными методами очистки.

4.Подбор особыхмаксимально чувствительных и специфичных методов ана-

лиза.

5.Необходимость правильной оценки результатов анализа – экспертное заключение. Эксперт имеет возможность говорить лишь об обнаружении или необнаружении искомого вещества. Так, например, отрицательный результат исследования не всегда свидетельствует об отсутствии ядовитого вещества (его следы могут оставаться в объекте, но не обнаруживаться). И наоборот, некоторые из веществ, на которые токсикология указывает как на ядовитые, являются естественными составными частями организма (катионы Cu, As, Hg, Zn, Pb и др.). В этих случаях обязательнаколичественная оценка.

6.При анализе биомассынеобходимо учитывать,что многие токсичныевещества, особенно органической природы, подвергаются в организме различным процессам биотрансформации, направленным в основном на обезвреживание вещества.Эти факторыоказывают значительноевлияниенарезультаты анализа.

21

Изъятие объектов для судебно-химического исследования:

•С целью обнаружения и количественного определения ядовитых веществ для СХА изымают и направляют различные внутренние органы, кровь и мочу с учетом природы яда и путей введения его в организм, распределения,путей и скорости выведения, длительности течения интоксикации и лечебных мероприятий. Направляют также рвотные массы, первые порции промывных вод, остатки лекарственныхи химическихвеществ, пищи,напитков идругие объекты.

•При подозрении на отравление ядовитым веществом направляют комплекс внутренних органов – желудок с содержимым, 1 м тонкой кишки, 1/3 печени, 1 почку, всю мочу и не менее 200 мл крови.

• При подозрении на введение яда через влагалище или маткудополн и- тельно направляют отдельно матку и влагалище.

•При подозрении на подкожное или внутримышечное введение – участок кожи или мышцы из области меставведения.

•При подозрении на ингаляционное введение – 1/4 легкого, 1/3 головного мозга.

•При обнаружении в содержимом желудка крупинок, кристаллов, таблеток они также направляются наисследование.

Дополнительно к указанному комплексу внутренних органов и биожидкостей направляют в случае подозрения на отравление:

•кислотами, щелочами – глотку, трахею и пищевод, участки кожи со следами действия яда.

•летучими хлорорганическими веществами (хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорметан, хлорорганические пестициды и другие алкилгалогениды) – сальник, 1 /3 головного мозга.

•метиловым спиртом– 1/3 головного мозга.

•гликозидами – 1/3 печени с желчным пузырем.

•фосфорорганическими соединениями – обязательно кровь (для определения активности холинэстеразы).

22

•солями ртути – прямую кишку, волосы.

•хронические отравления соединениями свинца, таллия - плоские кости.

•хронические отравление соединениями мышьякаволосы, ногти, плоские

кости.

•тетраэтилсвинцом – мозг и легкие.

•окисью углерода – кровь, мышечную ткань.

•этанолом – кровь из крупных вен, мочу; при невозможности– около 500 г мышечнойткани.

•метгемоглобинобразующими ядами (анилин, нитробензол, перманганат

калия, формальдегид, хроматы, ацетальдегид) – кровь на метгемоглобин.

• грибами и ядовитыми растениями – непереваренные кусочки из содержимого желудка, рвотные массы, промывные воды.

Порядок проведения и основные правила судебно-химического анализа (СХА)

1.Судебно-химическая экспертиза должна быть начата в день поступления объектов на анализ. Если этоневозможно, то объекты хранят в холодильнике.

2.Приступая к СХА, эксперт тщательно осматривает объекты и описывает

врабочем журнале, устанавливая полное соответствие полученных объектов с описанием их в сопроводительном документе.

3.Эксперт тщательно изучает все сопроводительные материалы и составляет план исследования

4.Для проведения СХА расходуют 2/3 присланных объектов, 1/3 остается в архиве (для повторного анализа, если возникнет необходимость). Однако при ограниченном количестве расходуют весь объект по согласованию с приславшей организацией.

5.Исследование в зависимости от поставленных вопросов может быть проведено на определенное соединение, группу веществ или на неизвестное вещество по схеме общего СХА (скрининг-анализа)

23

6.Для исследования всегда нужно применять только те методы и процедуры, с которыми эксперт ранее ознакомился, владеет ими, знает все условия, сможет учесть все ошибки, которые могут возникать. Все методики должны быть заранее апробированы. Основной задачей СХА является выбор оптимального метода изолирования. Для качественного обнаружения используют предварительные и подтверждающие методы, с учетом их чувствительность и специфичности.

7.Каждое судебно-химическое исследование следует проводить как коли-

чественное, в которое оно может быть превращено на любой стадии работы.

8.Количественное определение производят во всех случаях, где это возможно и имеются соответствующие методики определения. Количество найденных веществ относится к 100 г навески объекта и выражается в весовых единицах.

9.Все методы количественного определения должны быть апробированы на той биологической матрице, которая будет использоваться для анализа (кровь, моча, ткани органов) по схеме модельных опытов.

10.Следует убедиться в химической чистоте используемых для анализа реактивов,при этомначистотуреактивыпроверяют в тех максимальныхколичествах,в которых они будут употреблены для анализа и теми же методами и реакциями, которые будут применены в ходе СХА.

11.Для обеспечения высокого качества производства экспертизы рекомендуется производить внутрилабораторный и внешний контроль качества, ориентированный как на метод, так и на определяемое вещество. Судебнохимическое отделение должно быть лицензировано(аттестовано).

24

В курсе токсикологической химии мы рассматриваем методы изолирования и последующего определения следующих групп токсичных веществ:

•Группа токсикологически важных веществ, анализируемых после предварительной минерализации биомассы («Металлические яды»).

•Группа токсикологически важных веществ, изолируемых дистилляцией с водянымпаром («Летучие яды»).

•Группа токсикологически важных веществ, изолируемых экстракцией неполярными растворителями (пестициды, боевые ОВ и др.).

•Группа токсикологически важных веществ, требующих особых методов изолирования.

•Группа токсикологически важных веществ, не требующих изолирования из объектов исследования.

•Группа токсикологически важных веществ, изолируемых методом диализа.

•Группа токсикологически важных веществ, изолируемых экстракцией и сорбцией («Нелетучие яды» или «Лекарственные яды»).

25