Производственный контроль предприятий отрасли. Лабораторный практикум. Учебное пособие

первые несколько дней. Высокая влажность растений, обусловливающаяся наличием в измельченной силосной массе клеточного сока растений и анаэробные условия в силосохранилище– идеальные условия для роста клостридий. Поэтому уже к концу первых суток их численность возрастает. В случае слабого накопления молочной кислоты и снижения рН маслянокислые бактерии энергично размножаются, и число их достигает максимума (103-107 клеток/г) в несколько суток. Оптимальная температура для роста большинства этих бактерий около37 оС. Высокой термоустойчивостью характеризуются споры клостридий. Поэтому маслянокислые бактерии могут долгое время сохраняться в силосе в виде спор и при попадании в благоприятные условия для их развития начинают размножаться. Этим объясняется расхождение в биохимических и микробиологических показателях силоса: масляная кислота отсутствует, а титр маслянокислых бактерий в этих же образцах корма высокий.

Гнилостные бактерии (Bacillus, Pseudomonas). Представи-

тели рода бацилл (Bac. mesentericus, Вac. megatherium) сходны по своим физиолого-биохимическим особенностям с представителями клостридий, но в отличие от них способны развиваться в аэробных условиях. Поэтому они одними из первых включаются

впроцесс ферментации и чаще всего встречаются в количестве 104-106, но в некоторых случаях (нарушения технологии) – до 108- 109. Они используют в качестве питательных веществ различные белки, углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу и др.) и органические кислоты. Значительная часть белкового азота (до 40 % и более) под действием бацилл может быть переведена в аминную и аммиачную форму, а часть аминокислот в моно- и диамины. При декарбоксилировании могут возникать амины. Некоторые из них обладают токсическими свойствами(индол, скатол, метилмеркаптан и др.), и при скармливании силоса эти вещества, поступая

вкровь, вызывают различные заболевания и отравления животных. Важным свойством гнилостных бактерий, которое имеет значение для протекающих в кормовой массе процессов, является их способность к спорообразованию.

71

Ход работы

1. Выделение и учет молочнокислых бактерий. Подготовка исследуемого материала к анализу. Среднюю пробу (весом 0,5- 1,0 кг) исследуемого материала (силоса или сенажа) тщательно перемешивают и измельчают на кусочки длиной1-2 см. Затем навеску массой 50 г помещают в стерильный гомогенизатор, добавляют 450 см3 стерильной водопроводной воды и в течение 1 мин гомогенизируют. Полученную суспензию разбавляют до 105-106 раз стерильной водопроводной водой(5 см3 суспензии + 45 см3 воды), взбалтывают каждое разведение в течение 5 мин.

Высев суспензии на элективные среды осуществляют по 1 см3 суспензии – при глубинном посеве, по 0,05-0,1 см3 суспензии при посеве в жидкие среды.

Определение количества молочнокислых бактерий проводят на капустном агаре с мелом (среда 1) и на капустном агаре со спиртом и мелом (среда 2) – глубинный посев.

Подсчет колоний молочнокислых бактерий на капустном агаре с мелом проводится на5-6 день, а на капустном агаре со спиртом и мелом – на 7-10 день.

Среда 2 необходима для выявления молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры и свежих(с высоким содержанием сухого вещества) силосов, так как спирт заметно тормозит рост посторонней микрофлоры на5-10 сут. Посевы ставят

втермостат при 28 оС.

2.Выделение и учет маслянокислых бактерий. Титр масля-

нокислых бактерий устанавливают на жидкой картофельной среде (среда 5). Для определения количества спор маслянокислых

бактерий проводят посев из суспензии после пастеризации в -те чение 10 мин при 75 оС на 5-7 сут. Посевы ставят в термостат при 28 оС.

Учет результатов анализа ведут по интенсивности и выделения газа (кусочки картофеля всплывают на поверхность жидкости), титр маслянокислых бактерий и их спор устанавливают по методу предельных разведений.

3.Выделение и учет аэробных гнилостных микроорганиз-

мов. Количество посторонней микрофлоры(аэробных гнилост-

72

ных микроорганизмов) определяется глубинным посевом на пептонном агаре. Подсчет колоний ведется на 5-7 день при 28 оС.

Количество спор аэробных гнилостных бацилл на специальной среде (мясопептонный агар + сусло-агар). Посев поверх-

ностный (0,05 см3), подсчет колоний ведут на4-й день (при 28 оС).

Посевы ставят в термостат при28 оС и по истечении 7 сут ведут учет результатов роста гнилостных бактерий путем подсчета колоний при 28 оС.

Среда 3. Пептонный агар: пептон ― 5 г,

К2НРО4 ― 1 г, К3РО4 ― 0,5 г, MgSO4 ― 0,5 г,

NaCl ― следы,

водопроводная вода ― 1 дм3, агар, хорошо промытый ― 15-20 г, стерилизация при 1 атм. 20 мин.

Среда 8. Мясопептонный агар и сусло-агар 1:1. Стерилизовать при 101 кПа 30 мин.

Контрольные вопросы

1.Какая микрофлора называется эпифитной?

2.Какие микроорганизмы относят к молочнокислым? Какова их роль при силосовании?

3.Каковы методы выделения и учета молочнокислых бак-

терий?

4.Какие микроорганизмы относятся к возбудителям маслянокислого брожения?

5.Каковы основные биологические свойстваClostridium butyricum?

6.Какова роль маслянокислых бактерий при сенажировании и силосовании?

7.В чем сходство и различие гнилостных бактерий с возбудителями маслянокислого брожения?

73

8. Каково влияние протеолитических бактерий на качественные показатели готового силоса и сенажа?

Лабораторная работа № 13.

Качественный анализ готовых форм лекарственных препаратов витаминов

Цель работы: освоить способы оценки качества лекарственных препаратов витаминов.

Реактивы и материалы: тиамина хлорид, пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин, кислота фолиевая, кислота никотиновая, никотинамид, вода дистиллированная, этанол, хлороформ, эфир, безводный карбонат натрия, раствор сульфата меди с массовой концентрацией 0,1 мг/см3, раствор тиоцианата аммония с массовой концентрацией 0,1 мг/см3, 0,1 н раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/дм3 раствора соляной кислоты, раствор перманганата калия массовой концентрацией0,01 мг/см3, аммиачный буферный раствор молярной концентрацией0,1 моль/дм3, раствор

2,6-дихлорхинонхлоримида молярной концентрацией 0,1 моль/дм3, бутанол, раствора ацетата натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3.

Теоретические сведения

Витамины – группа низкомолекулярных органических веществ, которые в очень низких концентрациях оказывают сильное и разнообразное биологическое действие.

В природе источником витаминов являются, главным образом, растения и микроорганизмы. В промышленности витамины получают в основном химическим синтезом. Однако микробиологическое производство этих соединений также имеет место.

Микробиологическим путем получают витамин В (цианокоба-

12

ламин), В2 (рибофлавин), витамин С и эргостерин.

Витамин В12. Среди неполимерных соединений витамин В12 имеет самое сложное строение – α (5,6-диметилбензимидазол) — кобамидцианид.

74

ноидные соединения представители родаPropionibacterium. В семействе Propionibacteriacea есть и другие представители, спо-

собные к высокому накоплению витамина В в клетках. Это Eu-

12

bacterium limosum. Истинный витамин В в значительных коли-

12

чествах синтезирует Nocardia rugosa. Известны активные продуценты витамина В12 у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans и др. Интерес представляют термофильные бациллы, а именно Bacillus circulans. Высокой природной продуктивностью обладают представители мета-

нотрофов Methanosarcina, Methanococcus, среди которых выделен штамм Methanococcus halophilus, обладающий самым высоким среди природных штаммов уровнем продукции – 16 мг на 1 г биомассы.

Витамин В2. Витамин В2 (рибофлавин) в природе продуцируется растениями, дрожжами, мицелиальными грибами, а также некоторыми бактериями. Среди прокариот известными продуцентами флавинов являются микобактерии и ацетобутиловые бактерии. Из актиномицетов – Nocardia eritropolis. Среди мице-

лиальных грибов – Aspergillus niger и Eremothecium ashbyi.

75

Рибофлавин микробиологического производства используется исключительно как кормовая добавка в животноводстве

(рис.4).

Основным продуцентом кормового рибофлавина являетсяEremothecium ashbyi, который культивируют на кукурузной или соевой муке с минеральными добавками. Культивирование ведут до появления спор. Его лучшие продуценты, полученные с помощью мутаций и ступенчатого отбора, продуцируют до 600 мг/дм3 продукта. Затем культураль-

ную жидкость выпаривают и используют в виде порошковой добавки к кормам в животноводстве.

Эргокальциферол (витамин D2) -

одна из форм витаминаD, образуется при воздействии ультрафиолета на эргостерол. Регулирует обмен кальция и фосфора в организме.

Эргостерин – исходный продукт производства жирорастворимого витамина D2 (рис.5). Эргостерин является также основным стерином дрожжей, поэтому данные микроорганиз-

мы – основной источник для селекционных работ. Так, Saccharomyces

carlbergensis дает до 4,3 мг/дм3, S. ellipsoideus – 1,5 мг/дм3, Rhodotorula glutinis – 1 мг/дм3, Candida utilis – 0,5 мг/дм3 продук-

та. Наиболее широко в производстве используют дрожжи

Saccharomyces carlbergensis, а также S. cerevisiae.

В последние годы появились сообщения о промышленном производстве витамина С. Сообщается о конструировании генноинженерными методами продуцента: гены Corynebacterium перенесли в Erw. herbicola. В рекомбинантном штамме объединены способность эрвиний превращать глюкозу в глюконовую кислоту со способностью коринебактерий превращать последнюю в гулоновую кислоту, которую химическим способом превращают в аскорбиновую кислоту.

76

Таким образом, витамины используются и как кормовые витамины, и как лекарственные препараты, поэтому при производстве витаминов большое значение уделяется контролю качества готовой формы препарата.

Ход работы

1. Определение физических свойств лекарственных препа-

ратов витаминов. Описать свойства испытуемых лекарственных препаратов. Результаты оформить в виде табл. 11 и сопоставить с данными, приведенными в табл. 12.

табл. 13, пользуясь сокращенными обозначениями условных терминов растворимости (см. табл. 12), и сопоставить с требованиями, приведенными в табл. 14 (см. графу «Растворимость»).

77

78

2. Определение подлинности лекарственных препаратов витаминов. В пробирку помещают 0,1 г препарата никотиновой кислоты и 0,1 г безводного карбоната натрия, растворяют в 1 см3 дистиллированной воды и осторожно нагревают. Развивается запах пиридина.

К3 см3 теплого раствора препарата никотиновой кислоты,

растворенного в дистиллированной воде в соотношении1:100 по объему, приливают 1 см3 раствора сульфата меди с массовой концентрацией 0,1 мг/см3. Выпадает осадок синего цвета.

К10 см3 раствора препарата никотиновой кислоты, раство-

ренного в дистиллированной воде в соотношении1:100 по объему прибавляют 0,5 см3 раствора сульфата меди и 2 см3 раствора

0,1 моль/дм3 раствора соляной кислоты и 1 см3 раствора перманганата калия массовой концентрацией 0,01 мг/см3. Раствор помещают на 3 мин в водяную баню при температуре 80-85 оС. После охлаждения прибавляют по каплям0,2 см3 раствора пероксида водорода и фильтруют. Фильтрат имеет голубую флуоресценцию

10 см3 дистиллированной воды. К 0,1 см3 полученного раствора прибавляют 1 см3 воды, 2 см3 аммиачного буферного раствора, 1 см3 раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида, 2 см3 бутанола и встряхивают в течение 1 мин. В слое бутанола появляется голубое окрашивание.

Растворяют 0,05 г препарата тиамина хлорида(бромида) в 25 см3 воды. К 5 см3 раствора приливают 1 см3 раствора гексацианоферрата (III) калия, 1 см3 раствора 0,1 моль/дм3 гидроксида на-

79

0,1 моль/дм3 раствора гидроксида натрия. Появляется запах аммиака.

3. Определение основного вещества в лекарственных пре-

паратах витаминов. Количественное определение никотиновой кислоты. Около 0,3 г препарата (точная масса) помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 25 см3 свежепрокипяченной горячей дистиллированной воды, и по охлаждении титруют 0,1 моль/дм3 раствором гидроксида натрия до неисчезающего в течение 1-2 мин розового окрашивания (индикатор – фенолфталеин). 1 см3 0,1 моль/дм3 раствора гидроксида натрия соответствует 0,01231 г кислоты никотиновой, которой в препарате должно быть не менее 99,5 % в пересчете на сухое вещество.

Количественное определение кислоты фолиевой(провести фотоколориметрическим методом). Около 0,05 г препарата (точная масса) растворяют в смеси 50 см3 воды и 2 см3 концентрированного раствора аммиака в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Переносят 1 см3 испытуемого раствора в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем раствора до метки раствором гидрофосфата калия, перемешивают и используют для приготовления испытуемого раствора.

80