Производственный контроль предприятий отрасли. Лабораторный практикум. Учебное пособие

тации и зону плазмокоагуляции, а в мазках, окрашенных по Граму, выявлены овоидные клетки, собранные парами или скоплениями, то их относят к бактериям рода Staphylococcus,

виду S. aureus.

3. Метод выявления осмотолерантных дрожжей и плесне-

вых грибов. Для выявления осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов в анализируемом пробиотическом препарате (пробиотической кормовой добавке, закваске, молочной сыворотке) анализируемую пробу или его исходное разведение высевают в соответствии на поверхность одной из предварительно подсушенных агаризованных питательных сред, агаризованной среды для выделения дрожжей по ГОСТ 31928-2013 и среды Сабуро.

Посевы инкубируют в течение7 сут при температуре (24±1) °С. Через 3 сут проводят предварительную оценку результатов инкубирования посевов, а через 7 сут - окончательную.

Для определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках Петри вырастает не менее 15 и не более 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 для плесневых грибов.

Колонии осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально. Рост осмотолерантных дрожжей на агаризованных питательных средах сопровождается образованием выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Рост осмотолерантных плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Контрольные вопросы

1.Какова сущность метода определения общего числа мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)?

2.Какова сущность метода выявления бактерий рода

Staphylococcus?

3.Какова сущность метода выявления осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов?

61

Лабораторная работа № 11.

Определение протеолитической активности ферментного препарата протеаз

Цель работы: овладеть методикой определения протеолитической активности ферментного препарата протеаз.

Реактивы и материалы: 2 г исследуемого ферментного препарата, 2,000 г воздушно-сухого казеината натрия, 10 см3 соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3, 10 см3 гидроокиси натрия молярной концентрацией1 моль/дм3, 4 см3 раствора ТХУ, 5 см3 раствора углекислого натрия молярной концентрацией 0,5 моль/дм3, 1 см3 рабочего раствора реактива Фолина, 181,2 мг чистого тирозина, 1 дм3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией0,2 моль/дм3, раствор уксусной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3, раствор ортофосфорной кислоты молярной концентрацией1 моль/дм3, раствор борной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3.

Теоретические сведения

За единицу протеолитической активности принята способность фермента превращать 1за мин при температуре 30 °С казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина.

Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Активность бактериальных протеиназ определяют при значениях рН в следующих диапазонах:

(2,5±0,2) и (5,5±0,2) - кислые протеиназы; (7,2±0,2) - нейтральные протеиназы; (9,5±0,2) - щелочные протеиназы.

Приготовление растворов

Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с -по следующим их определением.

62

Приготовление универсального буферного раствора 1Уб молярной концентрацией 0,1 моль/дм3. Для приготовления уни-

версального буферного раствора Уб готовят растворы молярной

1

концентрацией 0,1 моль/дм3: уксусной кислоты (раствор А), ортофосфорной кислоты (раствор В) и борной кислоты (раствор С)

исмешивают их в равных соотношениях. Получают буферный

раствор С рН 1,8. Добавляя к этой смеси различные объемы раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией1 моль/дм3, получают буферные растворы: а) рН реакционной смеси (2,5±0,2)

и(5,5±0,2) (для кислых протеиназ); б) рН реакционной смеси (7,2±0,2) (для нейтральных протеиназ); в) рН реакционной смеси (9,5±0,2) (для щелочных протеиназ).

ра Уб1 с соответствующим рН реакционной смеси. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью100 см3, доводят этим же буферным раствором объем жидкости до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности, используя этот же буферный раствор.

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторениях. Для испытания берут две параллельные навески препарата. Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

рН 5,5 (для кислых протеиназ) добавлением нескольких капель раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3, а до рН 7,2 (нейтральных) и 9,5 (щелочных) добавлением нескольких капель раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3.

63

1 см3 рабочего раствора реактива Фолина.

64

Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне 0,07-0,45 для кислых протеиназ и0,2-0,6 для нейтральных и щелочных протеиназ.

При отклонении оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы.

Построение градуировочной характеристики. Для вычис-

ления протеолитической активности строят градуировочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирозиновый эквивалент (ТЭ), то есть ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см3 стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждой новой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектрического колориметра.

Для построения градуировочной характеристики готовят раствор тирозина концентрации 10-3 моль/дм3. Для этого 181,2 мг чистого тирозина растворяют в растворе соляной кислоты моляр-

с3 - 1,5·1010-4 моль/дм3 или 0,15 мкмоль/см3;

65

ПС=D·4/(ТЭ·10·m)·1000,

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; 4 - отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после -до бавления ТХУ; ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной характеристике, мкмоль/см3; 10 - время гидролиза субстрата, мин; m - масса ферментного препарата, взятая на протеолиз (расчет ведется на1 см3ферментного раствора), мг; 1000 - переводной коэффициент полученных единиц на1 г ферментного препарата.

66

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе 2 параллельных навесок препарата. Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей 2 параллельных навесок не должно превышать 5 %. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности P = 0,95 составляет 5 %.

Контрольные вопросы

1.На чем основан метод определения протеолитической активности?

2.Что такое протеолитическая активности ферментного препарата?

3.В чем заключается сущность метода определения протеолитической активности ферментного препарата?

4.Каковы правила построения градуировочного графика для определения протеолитической активности?

Лабораторная работа № 12.

Основные микробиологические методы определения качества кормов

Цель работы: овладеть методикой выделения и учета молочнокислых, маслянокислых и гнилостных бактерий при определении качества кормов.

Реактивы и материалы: чашки Петри, тест-культуры молочнокислых микроорганизмов на плотной – среде Lactobacterium plantarum, тест-культуры маслянокислых бакте-

рий в жидкой среде – Clostridium butyricum, стерильная водопроводная вода, исследуемый корм (образцы силоса или сенажа), капустный агар с мелом (среда 1), капустный агар со спиртом и мелом (среда 2), жидкая картофельная среда (среда 3), пептон 5 г,

К2НРО4 1 г, К3РО4 0,5 г, MgSO4 0,5 г, NaCl 0,1 г, агар, хорошо

67

промытый 15-20 г, 20 г мясопептонного агара и сусло-агар, смешанных в соотношении 1:1.

Теоретические сведения

Консервирование кормов в настоящее время сопровождается большими потерями. Если силосование выполняется надлежащим образом, к примеру, в горизонтальных силосохранилищах потери составляют в среднем около 20 %. При неквалифицированной работе они значительно возрастают. Величину потерь, вызванных деятельностью микроорганизмов кормов, часто недооценивают. При составлении кормового баланса предусматриваются только «неизбежные» потери в результате «угара». Однако следует иметь в виду, что силос, находившийся под испорченным в результате вторичного брожения слоем(верхний и боковые слои), характеризуется высоким рН и непригоден для скармлива-

ния. Сенаж, подвернувшийся самосогреванию в результате аэробных процессов, теряет свое кормовое достоинство наполовину. Плесневелое сено, зерно, кислый силос является причиной многих болезней сельскохозяйственных животных.

Знание физиолого-биохимических особенностей отдельных групп микроорганизмов, встречающихся в консервированных кормах, и факторов, ограничивающих или стимулирующих их развитие необходимо для того, чтобы исключить ошибки при заготовке, хранении и скармливании консервированных кормов.

1. Краткая характеристика микроорганизмов кормов.

Эпифитная микрофлора – это микроорганизмы, встречающиеся на поверхности растущих растений. Ее количественный и качественный (видовой) состав сильно колеблется и зависит от времени года, местности, вида и стадии развития растений, степени их загрязненности и многих других условий. Так, на 1 г сырой массы приходилось следующее количество микроорганизмов: свежая лугопастбищная трава – 16 000, люцерна – 1 600 000, кукуруза – 17 260 000. На растениях находится огромное количество разнообразных микроорганизмов, однако это количество незначительно по сравнению с плотностью микроорганизмов после закладки и хранении в том или ином хранилище.

68

В разнообразной микрофлоре содержится лишь сравнительно небольшое количество молочнокислых бактерий (табл. 9).

Таблица 9

Количественный и качественный состав микроорганизмов, клеток/г

2. Микробиологические процессы, происходящие при сило-

совании. Количественный и качественный(видовой) состав сообщества микроорганизмов, участвующих в созревании силоса, также зависит от ботанического состава зеленой массы, содержания в ней растворимых углеводов и протеина, влажности исходной массы. Так, например, сырье богатое белками(клевер, люцерна, донник, эспарцет) в отличие от сырья, богатого углеводами (кукуруза, просо и др.), силосуется при длительном участии в процессах гнилостных бактерий и при замедленном нарастании численности молочнокислых бактерий. Однако в любом случае после закладки растительной массы в хранилище наблюдается массовое размножение микроорганизмов. Их общее количество уже через 2-9 сут может значительно превышать количество микроорганизмов, попадающих с растительной массой (табл. 10).

При всех способах силосования в созревании силосов участвует сообщество микроорганизмов, состоящее из двух групп: вредные (нежелательные) и полезные (желательные). Характер их взаимоотношений варьирует не только от симбиотических до антагонистических факторов, но и от природы силосуемого материала, воздушного и температурного режима.

Таким образом, в процессе силосования происходит замена гнилостных микроорганизмов молочнокислыми, которые вследствие образования молочной и частично уксусной кислот снижают рН корма до 4,0-4,2 и тем самым создают неблагоприятные условия для развития гнилостных микроорганизмов.

69

Таблица 10

Динамика развития молочнокислых и гнилостных микроорганизмов при силосовании кукурузы и клевера

Молочнокислые бактерии. Среди разнообразной эпифитной микрофлоры растений содержится лишь сравнительно - не большое количество неспорообразующих факультативных анаэробов, гомо, - гетероферментативных молочнокислых бактерий

(Streptococcus sp., Pediococcus sp., Lactobacterium plantarum

и др.). Их численность при благоприятных условиях силосования быстро достигает 104-108, а иногда – 109, а оптимальным количеством считают 105-107 клеток/г сырого материала. Образуемая ими в качестве продукта брожения молочная кислота создает в среде активную кислотность(рН 4,2 и ниже), неблагоприятно действующую на нежелательные микроорганизмы. Помимо этого, значение молочнокислых бактерий заключается в бактерицидном действии недиссоциированной молекулы молочной -ки слоты и способности их образовывать специфические антибиотические и другие биологически активные вещества.

Маслянокислые бактерии (Clostridium sp.) - спорообразующие, подвижные, палочковидные анаэробные микроорганизмы широко распространены в почве. Почти сразу же после заполнения хранилища зеленой массой маслянокислые бактерии начинают интенсивно размножаться вместе с молочнокислыми в

70