- •I. Введение. Грипп — заболевание с неизменяющейся симптоматикой, вызываемое изменяющимся вирусом
- •II. Таксономия вирусов гриппа
- •IV. Структурное и функциональное родство вирусов гриппа с другими рнк-содержащими вирусами
- •V. Антигенная изменчивость вируса гриппа и ее отличие от антигенной изменчивости других инфекционных агентов
- •VI. Нерешенные вопросы
- •Структура вируса гриппа
- •I. Введение
- •1. Число и функции полипептидов
- •4. Нейраминидаза
- •5.Белок нуклеокапсида
- •7. Количество полипептидов в вирионе
- •8. Вирусы гриппа в и с
- •1. Гемагглютинин
- •2. Нейраминидаза
- •IV. Сборка вирионов
- •V. Заключение. Модель вириона гриппа
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
- •II. Реакция гемагглютинации
- •1. Количественное определение гемагглютинации
- •2. Гемадсорбция
- •3. Ингибирование гемагглютинации
- •III. Структура гемагглютинина
- •1. Химический состав изолированных гликопептидов
- •2. Антигенные свойства гликопептида hAt
- •4. Структура субъединицы на
- •5. Антигенная гомогенность субъединиц на
- •1. Моновалентный гемагглютинин
- •2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина
- •IV. Функции гемагглютинина
- •V. Заключение
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза
- •II. Специфичность нейраминидазы
- •III. Субстраты для нейраминидазы
- •IV. Химические свойства нейраминидазы
- •V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса
- •1. Использование протеолитических ферментов
- •2. Использование детергентов
- •VI. Свойства изолированной нейраминидазы а. Состав аминокислот
- •VII. Структура нейраминидазы
- •VIII. Антигенные свойства нейраминидазы
- •IX. Лектины и нейраминидазы
- •X. Ингибиторы активности нейраминидазы
- •XI. Роль нейраминидазы
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа
- •I. Введение
- •II. Активность рнк-полимеразы в инфицированных клетках
- •IV. Заключение
- •Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
- •I. Введение
- •II. Методы
- •1. Экстракция рнк из вирионов
- •1. Анализ экстрагированной рнк с помощью градиентного центрифугирования
- •2. Анализ экстрагированной рнк с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (паагэ)
- •IV. Комплекс рнк с белком (рнп) а. Физические и химические свойства
- •2, Созревание и упаковка рнк в вирионы
- •1. Внутриклеточная локализация вкРнк
- •2. Кинетика синтеза вкРнк
- •3. Физические свойства информационной рнк (мРнк)
- •VI. Действие ингибиторов на синтез рнк
- •VII. Заключение
- •Генетика вируса гриппа
- •I. Введение. Исторический обзор
- •1. Исследования по генетике, проведенные Burnet и сотрудниками
- •2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb
- •II. Геном вируса гриппа
- •III. Мутации, изменчивость, адаптация
- •1. Модификация вирусных гликопротеидов
- •2. Модификация вирусной оболочки
- •3„ Модификации с помощью протеолитических ферментов
- •1964) Или к гуанидвнгидрохлориду (David-West, 1973) явля
- •2. Фенотипы, относящиеся к нейраминидазе
- •3. Морфология вириона
- •1. Чувствительность к клетке-хозяину
- •2. Патогенность
- •3. Механизм рекомбинации
- •10% От выхода вируса при разрешающей температуре. Шля1
- •V!. Фенотипическое смешение и гетерозигозис
- •VII. Изучение функции генов с помощью ts-мутантов
- •VIII. Заключение
- •Репликация вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Адсорбция, проникновение, «раздевание» вируса
- •III. Транскрипция а. Последовательность синтеза рнк
- •2. Циклогексимид
- •3. Глюкозамин
- •IV. Синтез вирусных белков
- •2. Белок нуклеокапсида
- •3. Неструктурные белки
- •4. Мембранный м-белок
- •5. Гемагглютинин
- •VI. Синтез липидов
- •VII. Сборка (см. Также гл. 2)
- •IX. Неправильные формы размножения
- •Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала
- •I. Введение
- •II. Культивирование вирусов в лабораторных условиях
- •1. Продуктивная инфекция
- •2. Абортивная инфекция
- •3. Персистентная инфекция
- •4. Параметры инфекции
- •IV. Выделение вируса
- •Антигенная изменчивость вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Грипп в историческом аспекте (см. Также гл. 15)
- •III. Свойства генома вируса гриппа
- •IV. Субъединицы гемагглютинина
- •V. Механизм антигенного дрейфа
- •1955, 1956; Magill, 1955; Hamre et al., 1958). Эпидемиологиче
- •1956, 1957; Takatsy, Furesz, 1957), антигены постепенно за
- •VI. Механизм антигенных сдвигов (значительных антигенных изменении)
- •VII. Дополнительные доказательства,
- •2. Естественная передача вируса и селекция
- •3. Селекция и передача «нового» вируса гриппа в системе in vivo
- •1. Антигенные соотношения между вирусами гриппа человека, низших млекопитающих и птиц
- •2. Круг хозяев
- •Иммунология гриппа
- •I. Введение
- •II. Проявления иммунитета
- •1. Устойчивость к инфекции
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •4. Механизм действия антител к na
- •V. Влияние антигенного дрейфа на иммунитет
- •VII. «первородный антигенный грех»
- •VIII. Клеточный иммунитет и грипп
- •IX. Заключение
- •Грипп у человека
- •2. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа а
- •3. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа в
- •7. Изменения бактериальной флоры
- •8. Функция легких при неосложненном гриппе
- •9. Выделение больными вируса в окружающую среду
- •10. Интерферон
- •11. Продукция антител
- •1. Пневмония
- •2. Острые заболевания нижних дыхательных путей у детей
- •3. Обострение хронического бронхита
- •III. Экспериментальная гриппозная инфекция у человека
- •3. Продукция интерферона при заболевании
- •IV. Выводы и заключение
2. Циклогексимид
При добавлении циклогексимида, специфически подавляющего синтез белков в клетках животных, через 2 ч после заражения вирусом гриппа образование вРНК немедленно прекращается, тогда 1как образование вжРНК все еще продолжается по крайней мере в течение 2 ч (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Пока неизвестно, необходим ли непрерывный синтез вирусного 'или 'Клеточного 'белка, используемого в 'Качестве /кофактора для полимеразы, синтезирующей вРНК, или необходим некоторый 'белок (например, NP-белок) для стабилизации вновь синтезированной вРНК, или подавление синтеза определенного вирусного 'белка приводит к непрерывному образованию вкРНК, синтез которой в норме выключается через 3 ч после заражения. Это выключение может ■быть необходимо для запуска синтеза вРНК- Исследования с темпер атурочуветвительными мутантами должны ответить на некоторые из этих вопросов.
Опыты Bean и Simpson (1973) показали, что первичная транскрипция in vivo (синтез вкРНК на матрице ъРНК с помощью полимеразы инфицирующей частицы) не подавляется циклогексимидом, тогда ка,к актиномицин D подавляет транскрипцию полностью. Таким образом, циклогексимид не воздействует in vivo на активность полимеразы, вводимую с инфицирующей частицей и синтезирующую вкРНК- Он, однако, подавляет синтез новой полимеразы, необходимой для производства вкРНК.
3. Глюкозамин
Глюкозамин, как известно, истощает пул УТФ в клетках куриного эмбриона путем образования УТФ-]М-ацетилглкжо-замина (Scholtissek, 1971). Когда раствор Эрла, содержащий глюкозу, используется в качестве жультуральной среды, он
оказывает влияние только на синтез вирусных глнкопротеи-нов (см. раздел V). Если, однако, глюкозу как источник энергии заменить лируватом или фукозой, то истощение пула УТФ этими аминосахарами происходит примерно в 10 раз активнее. При этих условиях пул УТФ клетки-хозяина становится специфическим ограничителем акорости синтеза вРНК, тогда как синтез (клеточной РНК еще не затрагивается (Scholtissek, 1975). В результате подавления синтеза вирусной РНК отсутствует и образование вирусных белков.
Эти данные могут быть интерпретированы двояко: или вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза имеет низкое сродство к УТФ по сравнению с клеточными ДНК-зависимым'и РИК-полимеразами, или в клетке существуют два более или менее независимых пула УТФ, один из которых может 'быть использован для синтеза вирусной РНК и испытывает большее воздействие со стороны глюкозамина, чем другой пул, который может использоваться в качестве субстрата РНК-по-лимеразами «летки.
Г. СИНТЕЗ ВИРУСНОЙ РНК IN VITRO
В клетках, зараженных вирусом гриппа, несколькими исследователями обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (Но, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans, Cali-guiri, 1973). Большая часть активности фермента обнаружена в микросомальной фракции зараженных клеток. В системе in vitro эта активность снимается РНК-азой, но не ДНК-азой. Это значит, что внутренней матрицей является РНК- Реакция требует присутствия всех четырех нуклеозидтрифосфатов и чувствительна к актином-ицину D. Большая часть продукции реакции in vitro имеет низкую относительную молекулярную массу. Данные Horisberger и Guskey (1973) предполагают, что в цитоплазме присутствуют две различные активности ферментд: одна является М§++-завиеимой и подавляется относительно высокими концентрациями солей, другая — Мп++-зависима и более резистентна к солям. Последняя активность фермента обнаруживается также внутри вирусной частицы (см. гл. 5).
Относительно продукта цитоллазматического фермента в системе in vitro получены противоречивые результаты. Ruck ■и соавт. (1969) сообщили, что в их руках этот фермент синтезирует по крайней мере 'некоторые из РНК вирионного типа (от 14 до 19S). Авторы пришли ;к такому заключению при определении состава оснований продукта в системе in vitro после инкубации микросомальной фракции со всеми четырьмя [3Н] -меченными нуклеозидтрифосфатами известной удельной радиоактивности. Однако данные по изучению ближайших
к адениловой кислоте соседей, лолученные в той же работе с использованием ,[(а-32Р] АТФ, согласуются с данными анализа ближайших соседей, .полученными Scholtissek (1969), в результате чего был сделан вывод о том, что продукт в системе in vitro обладает структурой вкРНК. Mahy и Bromley (1970) в своей первоначальной публикации также заявили, что некоторая часть продукта в системе in vitro, полученного с помощью цитоплазматического фермента, должна 'быть вРНК. Однако недавно Hastie и Mahy (1973) при анализе ближайших соседей и специфической гибридизации подтвердили образование цитоплазматическим ферментом почти исключительно вкРНК, как это было впервые показано Scholtissek (1969). Caliguiri и Compans (1973) также выделяли РНК-по-лимеразу из цитоплазмы клеток, зараженных вирусом гриппа, которая в системе in vitro синтезировала РНК, не менее 90% которой имеет последовательность оснований, комплементарную чвРНК. Hastie и Mahy (1973) «ашли, что значительный процент продукта в системе in vitro, синтезируемого ядерным ферментом в присутствии актиномицина D, не -был способен пибридизоватьея с немеченой вРНК- Пока неясно, какого типа РНК не способна к такой гибридизация. Очень малая часть РНК, синтезируемой при этих условиях, гибри-дизуется с немеченой акРНК (Scholtissek, неопубликованные данные).
Кинетика включения меченого ГТФ в вирусную РНК может быть интерпретирована как свидетельствующая о том, что реинициация синтеза РНК в системе in vitro отсутствует. Если неочищенный препарат фермента инкубируют при низких концентрациях солей, почти вся вновь синтезированная РНК изначально является однонитчатой. Однако после экстракции фенолом 'большой процент РНК становится РНК-азорезистентным. Фенол переводит промежуточную реплика-тивную структуру,, состоящую из однонитчатой матрицы и вновь синтезированной вкРНК, удерживаемых друг с другом в месте репликации молекулой' полимеразы, в частично дву-нитчатую структуру (Feix et al., 1967; Oberg, Philipson, 1971). Эти данные о продукте фермента вируса гриппа в системе in vitro можно интерпретировать таким образом, что полимераза не только инициирует и продолжает полимеризацию, но она отделяет вновь синтезированную цепь от своей матрицы. В противном случае образуется двунитчатая структура РНК, которая не обладает 'биологическими функциями (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Если инкубация проводится при высокой концентрации солей или с очищенным ферментом, большой процент продукта уже является двунитчатой РНК до экстракции фенолом (Schwartz, Scholtissek, 1973).
Это свойство РНК-нолимеразы вируса гриппа синтезировать исключительно вкРНК в системе in vitro -было исполь-
.зовано для установления генетического родства различных штаммов вируса гриппа по определению гомологии в последовательности оснований между ними (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).