- •I. Введение. Грипп — заболевание с неизменяющейся симптоматикой, вызываемое изменяющимся вирусом
- •II. Таксономия вирусов гриппа
- •IV. Структурное и функциональное родство вирусов гриппа с другими рнк-содержащими вирусами
- •V. Антигенная изменчивость вируса гриппа и ее отличие от антигенной изменчивости других инфекционных агентов
- •VI. Нерешенные вопросы
- •Структура вируса гриппа
- •I. Введение
- •1. Число и функции полипептидов
- •4. Нейраминидаза
- •5.Белок нуклеокапсида
- •7. Количество полипептидов в вирионе
- •8. Вирусы гриппа в и с
- •1. Гемагглютинин
- •2. Нейраминидаза
- •IV. Сборка вирионов
- •V. Заключение. Модель вириона гриппа
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
- •II. Реакция гемагглютинации
- •1. Количественное определение гемагглютинации
- •2. Гемадсорбция
- •3. Ингибирование гемагглютинации
- •III. Структура гемагглютинина
- •1. Химический состав изолированных гликопептидов
- •2. Антигенные свойства гликопептида hAt
- •4. Структура субъединицы на
- •5. Антигенная гомогенность субъединиц на
- •1. Моновалентный гемагглютинин
- •2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина
- •IV. Функции гемагглютинина
- •V. Заключение
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза
- •II. Специфичность нейраминидазы
- •III. Субстраты для нейраминидазы
- •IV. Химические свойства нейраминидазы
- •V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса
- •1. Использование протеолитических ферментов
- •2. Использование детергентов
- •VI. Свойства изолированной нейраминидазы а. Состав аминокислот
- •VII. Структура нейраминидазы
- •VIII. Антигенные свойства нейраминидазы
- •IX. Лектины и нейраминидазы
- •X. Ингибиторы активности нейраминидазы
- •XI. Роль нейраминидазы
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа
- •I. Введение
- •II. Активность рнк-полимеразы в инфицированных клетках
- •IV. Заключение
- •Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
- •I. Введение
- •II. Методы
- •1. Экстракция рнк из вирионов
- •1. Анализ экстрагированной рнк с помощью градиентного центрифугирования
- •2. Анализ экстрагированной рнк с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (паагэ)
- •IV. Комплекс рнк с белком (рнп) а. Физические и химические свойства
- •2, Созревание и упаковка рнк в вирионы
- •1. Внутриклеточная локализация вкРнк
- •2. Кинетика синтеза вкРнк
- •3. Физические свойства информационной рнк (мРнк)
- •VI. Действие ингибиторов на синтез рнк
- •VII. Заключение
- •Генетика вируса гриппа
- •I. Введение. Исторический обзор
- •1. Исследования по генетике, проведенные Burnet и сотрудниками
- •2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb
- •II. Геном вируса гриппа
- •III. Мутации, изменчивость, адаптация
- •1. Модификация вирусных гликопротеидов
- •2. Модификация вирусной оболочки
- •3„ Модификации с помощью протеолитических ферментов
- •1964) Или к гуанидвнгидрохлориду (David-West, 1973) явля
- •2. Фенотипы, относящиеся к нейраминидазе
- •3. Морфология вириона
- •1. Чувствительность к клетке-хозяину
- •2. Патогенность
- •3. Механизм рекомбинации
- •10% От выхода вируса при разрешающей температуре. Шля1
- •V!. Фенотипическое смешение и гетерозигозис
- •VII. Изучение функции генов с помощью ts-мутантов
- •VIII. Заключение
- •Репликация вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Адсорбция, проникновение, «раздевание» вируса
- •III. Транскрипция а. Последовательность синтеза рнк
- •2. Циклогексимид
- •3. Глюкозамин
- •IV. Синтез вирусных белков
- •2. Белок нуклеокапсида
- •3. Неструктурные белки
- •4. Мембранный м-белок
- •5. Гемагглютинин
- •VI. Синтез липидов
- •VII. Сборка (см. Также гл. 2)
- •IX. Неправильные формы размножения
- •Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала
- •I. Введение
- •II. Культивирование вирусов в лабораторных условиях
- •1. Продуктивная инфекция
- •2. Абортивная инфекция
- •3. Персистентная инфекция
- •4. Параметры инфекции
- •IV. Выделение вируса
- •Антигенная изменчивость вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Грипп в историческом аспекте (см. Также гл. 15)
- •III. Свойства генома вируса гриппа
- •IV. Субъединицы гемагглютинина
- •V. Механизм антигенного дрейфа
- •1955, 1956; Magill, 1955; Hamre et al., 1958). Эпидемиологиче
- •1956, 1957; Takatsy, Furesz, 1957), антигены постепенно за
- •VI. Механизм антигенных сдвигов (значительных антигенных изменении)
- •VII. Дополнительные доказательства,
- •2. Естественная передача вируса и селекция
- •3. Селекция и передача «нового» вируса гриппа в системе in vivo
- •1. Антигенные соотношения между вирусами гриппа человека, низших млекопитающих и птиц
- •2. Круг хозяев
- •Иммунология гриппа
- •I. Введение
- •II. Проявления иммунитета
- •1. Устойчивость к инфекции
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •4. Механизм действия антител к na
- •V. Влияние антигенного дрейфа на иммунитет
- •VII. «первородный антигенный грех»
- •VIII. Клеточный иммунитет и грипп
- •IX. Заключение
- •Грипп у человека
- •2. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа а
- •3. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа в
- •7. Изменения бактериальной флоры
- •8. Функция легких при неосложненном гриппе
- •9. Выделение больными вируса в окружающую среду
- •10. Интерферон
- •11. Продукция антител
- •1. Пневмония
- •2. Острые заболевания нижних дыхательных путей у детей
- •3. Обострение хронического бронхита
- •III. Экспериментальная гриппозная инфекция у человека
- •3. Продукция интерферона при заболевании
- •IV. Выводы и заключение
V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса
Как было определено, для таких штаммов вируса гриппа, как А0/Ве1/42, который содержит нейраминидазу типа N1 (Skehel, Schild, 1971), как рекомбинант Х7, в состав которого входит нейраминидаза типа N2 (Laver, Kilbourne, 1966) и вируса гриппа В, штамм B/Lee (Laver, 1963), содержание нейраминидазы составляет около 7% от суммарного содержания белков в вирионе. Несмотря на совпадение величин, полученных в этих работах, было обнаружено, что количество нейраминидазы, включающейся в вирусную частицу, может быть недостаточным и зависит от типа клеток, на которых выращивают вирус, и от штамма вируса. Laver (1963) обнаружил, что количество NA* зависит от типа клеток-хозяев и составляет 6% от общего вирусного белка при выращивании вируса in ovo и 14%, если вирус выращивается на клетках почки теленка. Laver и Kilbourne (1966) обнаружили, что в рекомбннантном штамме X7(F1) (H0N2) содержится в 2 раза больше «ейраминидазы, чем в штамме X7(H0N2) при выращивании вирусов in ovo. Palese и Schulman (1974) обнаружили десятикратное различие в содержании нейраминидазы в двух антигенно идентичных лабораторных рекомби-нантах вируса гриппа (H0N2), выращенных in ovo. Mow-showitz и Kilbourne (1975) наблюдали подобные различия в нейраминидазной активности изолированных вирусов двух
штаммов Aichi (H3N2) дикого типа. Используя метод подсчета частиц, Seto (1964) обнаружил, что неполный вирус штаммов PR8 (H0N1) и Япония/305 (H2N2) обладает нейр-аминидазной активностью, в 2—4 раза меньшей, чем стандартный вирус.
Если считать, что содержание NA* составляет 7% суммарного (белка вириона (а белок составляет 70% массы всей вирусной частицы) (Frommhagen et al., 1959), и принять за массу одной вирусной частицы величины W = 4-10~16 (Reimer et al., 1966), то число молекул NA* на один вирион можно определить из следующего уравнения (Skehel, Schild, 1971). Предполагается, что NA* представляет собой тетрамер с относительной молекулярной массой 24 000 (Wrigley et al., 1973), а N — число Авогадро:
^%NA = 49 молекул NA па вирион
Kendal и соавт. (1968) определили абсолютное содержание белка на один вирион, равное 4-Ю-16 г, и, основываясь на содержании NA* в 10% от суммарного белка вириона и на ее молекулярной массе в 220 000, рассчитали, что в вирионе гриппа штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) содержится 100 молекул NA* на одну вирусную частицу. Поскольку, согласно расчетам Tiffany и Blough (1970), на поверхности вирусной частицы содержится 550—600 «шипов», можно считать, что 50—100 из них представляют собой NA*, а остальные 500—'НА*.
А. СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ
Для изучения свойств NA* (как ферментативных, так и антигенных) удобно иметь 'фермент, отделенный от других компонентов вирусной оболочки. Поскольку NA* локализована в вирусной оболочке, именно это предопределяет способы ее солюбилизации и отделение от вириона и других вирусных компонентов. Методы солюбилизации NA* можно разделить на две группы: а) солюбилизация с помощью протеолитиче-еких ферментов и б) солюбилизация с помощью поверхностно-активных веществ. Особенности выделения NA* с помощью обоих методов приведены в табл. 13.
Солюбилизация .NA*, по-видимому, не меняет ее ферментативных свойств. Активная в биологическом и антигенном отношении NA* была выделена протеолизом или с помощью поверхностно-активных веществ ионной и неионной природы (Drzeniek et al., 1966). После выделения NA* имела ту же, что и до выделения, величину Км, оптимум рН и Са2+-зави-симость (Drzeniek et al,, 1966). Выделенную из вириона после обработки детергентами или протеолитическими ферментами iNA* нейтрализовали антисывороткой в той же степени, что и NA* интактного вириона (Ea'sterday et al., 1969). Одна-
ко Webster и Laver (1967) обнаружили, что выделенная с помощью детергента -NA* типа N2 обладает «дефицитом» анти-генности по сравнению с антигенностью NA* того же типа in situ.
Было показано, что iNA* вируса гриппа штамма B/Lee является наиболее стабильной и может -быть выделена практически с 100% выходом после обработки вирионов SDS или трипсином (Laver, 1963). NA* вируса B/Lee, кроме того, нечувствительна к дезоксихолату натрия (Laver, 1963). Что .касается вируса гриппа типа А, то наиболее просто с помощью обработки SDS или протеолитическими ферментами выделяется -NA* из штаммов А2 (N2). Эта NA*, кроме того, относительно температурно-етабильна. Использование нейтральных детергентов позволило выделить NA* типа N2 (Webster, Darlington, 1969), а также iNA* типа N1, выделение которой в чистом виде особенно трудно (Gregoriades, 1972). Hoyle и Almeyda (1971) показали, что NA*, выделенная из штаммов вируса гриппа типа А2 (N2) и B/Lee, почти полностью устойчива к действию проназы и трипсина; NA*, выделенная из штаммов PR8 (N1) и свиного (N1), лишь отчасти устойчива, a NA* вируса гриппа типа А1 (N1) и штамма A/DSP (<N1) крайне чувствительна к проназе и трипсину. NA* вируса гриппа типов АО и А1, (Которые также чувствительны к действию протеолитических ферментов, разрушается под действием SDS и мочевины (Hoyle, Almeyda, 1971).
Для солюбилизации NA* такие методы, как разрушение ультразвуком, эфиром или денатурирующими агентами (мочевина или гуанидингидрохлорид), применимы в малой степени, вероятно, в связи ,с высокими агрегационными свойствами этого фермента. Разрушение вирионов с помощью эфира, по-видимому, высвобождает НА* и NA* в виде сополимер-ного агрегата (Hoyle, 1952; Davenport et al., 1960; Schafer). Этот вид разрушения вирусных частиц в основном использовали до того, как Laver изолировал NA* (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Paucker et al., 1959; Hoyle et al., 1961).
Предпочтительным является такой ,вид изоляции NA*, который не требует разрушения ковалентных связей. Использование детергентов для солюбилизации iNA* позволяет выделить и другие вирусные белки, которые в химическом отношении не отличаются от соответствующих вирусных компонентов, хотя и могут терять свою биологическую активность (Bucher, 1975). По-видимому, при протеолитической солюбилизации NA* теряет некоторую часть своей молекулы, необходимую для удержания фермента на вирусной оболочке и не участвующую в ферментативном акте. Lazdins и соавт. (1972) показали, что в отличие от изоляции NA* с помощью детергента (SDS) или лротеолитичеоком (трипсин) выделении из штамма B/Lee каждая субъединица фермента теряет
отрезок -молекулы в 7000; по данным Wrigley и соавт. (1973), при тех же условиях каждая субъединица NA* B/Lee теряет участок в 12 000.
Основное различие, наблюдаемое при лротеолитическом и детергентном выделении NA*, состоит в том, что при солюби-лизации с помощью протеолитичеоких ферментов она теряет способность к агрегации. При (протеолитичеоком выделении имеет место «действительная» солюбилизация, в то время как iNA*, полученная с помощью детергентов, агрегирует при удалении солюбилизирующего агента (Lazdins et al., 1972). Каждый этап очистки NA* после ее солюбилизацин с помощью детергента должен выполняться в его присутствии для того, чтобы, во-первых, иметь дело с ферментом в диссоциированном состоянии, а Ео-вторых, для предотвращения потери его активности. Laver и Valentine (1969), а также Rott и соавт. (1970) показали наличие агрегатов в препаратах iNA* типа N2 при удалении детергента. По данным Grego-riades (1972), при удалении детергента NA* штамма WSiN (N1) агрегирует и теряет свою активность. Webster (1970b) обнаружил высокую агрегационную способность для NA*, выделенной из вирионов с помощью детергента, даже в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида в условиях восстановления.