2. Патогенность

Является ли вирус патогенным при данном методе введения, зависит от его способности продуцировать инфекционное потомство в клетках в месте инокуляции или вокруг него. Чувствительность к клетке-хозяину и патогенность рассматриваются по существу как один и тот же феномен на различных уровнях. По той же самой причине, следовательно, критерий патогенности, выявляемой по совокупному росту вируса, может быть таким же строгим, ч<ак и образование бляшек в случае маркера чувствительности к клетке-хозяину. Это может также частично объяснить перераспределение вирулентности (раздел IA, 1д). Ранее уже упоминалось о возможной связи нейровн'рулентности с NA* NWS и о патогенности НА* для легких мышей либо NWS либо WSE при рекомбинации штамма Mel со штаммом NWS или WSE (раздел IA, 1в). Mayer и др. (1972) изучали штаммы NWS, А2/Япония/305 и их реком'бинанты (H0N2 и H2N1) с помощью чувствительного теста на нейровирулентность — размножение вируса в мозге иммуносупрессированных мышей. Ни H0N2, ни H2N1 не были вирулентными в той же мере, что и штамм NWS, но оба в отличие от родительского штамма А2 'размножались в мозге до определенного уровня. Авторы заключили, что нейровирулентность не была связана ни с одним лишь НА*, ни с одной лишь NA*. На основании этих данных в сочетании с приведенными выше можно предположить отличие Н2 и НЗ от НО и HI с точки зрения потенции к нейровирулентности. Можно предположить также, что с НА НО и HI ассоциирована неполная, но скрытая нейровирулентность, т. е. способность к ограниченному размножению в мозге; объединение с NA* штамма NWS позволяет вирулентности проявиться полностью. С другой стороны, НА* Н2 и НЗ не ассоциированы с ростам. Введение NA* штамма NWS приводит лишь к небольшому увеличению роста 'вирусов.

Приведенный постулат объясняет, почему нейровирулентность была связана с NA* штамма NWS при скрещивании штаммов Mel с NWS, тогда как эта нейровирулентность находилась под двойным генетическим контролем при скрещивании штаммов А2 и NWS. Подтверждением этих положений является обнаруженная теми же авторами способность к росту в мозге мышей штамма GAM (H1N1), хотя и в ограни-ченой степени, а также наблюдавшийся тоже ограниченный, но вполне определенный рост штамма Mel в мозге очень молодых мышей (Fraser, 1959b).

Более сложно обстоит дело с патогенноетью для легких мышей после интранаэального введения вируса. Большинство штаммов вируса гриппа, вероятно, наделено .потенциальной патогенноетью, TaiK как они могут быть легче адаптированы ж легким мышей, чем к их мозгу. Встречались случаи, когда вирулентность для легких .мышей была, по-видимому, связана с" НА* (MelxWSE или NWS, Burnet, Lind, 1952), с NA* (WSExCAM, Burnet, Lind, 1955; WSExSW, Burnet, Lind, 1956) или ни с тем, ни с другим (A2XPR8, Kilbourne, Murphy, 1960; ГонконгXPR8, Kilbourne et al., 1971; А/Анг-лия/939/69хРК8, McCahon, Schild, 1972). Какой из продуктов деятельности генов 'более способствует росту данного штамма вируса в легких мышей, может зависеть от комбинации штаммов вируса.

В разделе IVB, 1 уже упоминалось о связи летальности для куриных эмбрионов с НА* ВЧП при скрещивании его с вирусом Гонконг.

3. Способность к росту в полости аллантоиса куриных эмбрионов

4. Тип бляшек

Размер и морфология бляшек — с виду очень удобные маркеры, но они охарактеризованы неполно. Механизм и генетические основы их проявления совершенно неизвестны. Увеличенная окр а шив а ем ость нейтральным красным клеток, зараженных определенными штаммами вируса, приводящая к образованию бляшек с 'красной границей (r-признак; Su-giura, Kilbourne, 1966), обусловлена, как полагают, активацией лизосомальиых ферментов и, следовательно, особенностями инициации цитопатичеекого действия (Allison, Malluc-ci, 1965).

В. УСЛОВНО-ЛЕТАЛЬНЫЕ МУТАЦИИ

а. Температурочувствительные (ts) мутанты. Данные мутанты обеспечивают исследования ,по генетике вирусов животных наиболее удобными маркерами. Обсуждению ts-му-тантов отведено в дальнейших разделах так много места, что далее будут отмечены лишь те особенности ts-мутантов, которые резко отличают их от других маркеров.

1. Геном ts-мутантов может быть идентичным геному ви

руса дикого типа, за исключением одного локуса. Для таких

мутантов вопрос о совместимости генов или о полигенной природе маркера не должен возникать.

2. Мутации могут иметь место, по крайней мере теорети

чески, во всех генах. Следовательно, использование ts-мутан

тов может значительно расширить границы генетического

анализа, возможно, до размеров целого генома.

3. ts-мутанты могут обеспечить сильное разрешение, если

они ревертируют достаточно редко и не являются текучими.

Если продуктивная и абортивная инфекции различаются по

выходу вируса примерно в 100 раз (Sugiura et al., 1969;

Choppin, Pons, 1970), то некоторые ts-мутанты проявляют

более чем 106-кратное отличие при разрешающей и неразре

шающей температурах.

б. Мутанты, чувствительные к клетке-хозяину. Мутанты, чувствительные к клетке-хозяину, для вируса гриппа обнаружены не 'были. Их выделяли из вируса везикулярного стоматита, который во многих отношениях напоминает вирус гриппа (Simpson, Obijeski, 1974). В свете возможности участия генома клетки-хозяина в репликации вируса (Borland, Mahy, 1968; Mahy et al., 1972) и заметной зависимости успешного созревания от клетки-хозяина, ino-видимому, заслуживает поощрения попытка отыскать аналогичные мутанты и для вируса гриппа.

Y. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

А. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

1. Рекомбинация вирусов гриппа типа А

Для того чтобы изучать генетическую рекомбинацию с количественной точки зрения, в экспериментах должны быть выполнены следующие условия.

1. Смешанная инфекция должна проводиться в условиях

примерно равной репликации обоих вирусных штаммов.

2. Все клетки, присутствующие в системе, должны быть

заражены одновременно обоими вирусными штаммами. Ино-

кулирующий вирус должен ;быть полностью, насколько это

возможно, удален до появления потомственного вируса.

3. Потомственный вирус должен быть проанализирован

на такой системе хозяйских клеток, в которой все инфекци

онные частицы потомственного вируса могут быть зарегист

рированы.

4. Маркеры должны быть четко охарактеризованы и иден

тифицированы с полной определенностью.

Введение вируса в высокой концентрации, необходимой для одновременного заражения всех клеток вирусами обоих типов, неизбежно приводит в большей или меньшей степени

к появлению феномена фон-Магнуса. Следовательно, интерпретировать результаты необходимо всегда, исходя из .предположения, что инфекционный вирус генотипически отражает (по крайней мере в отношении применяемых маркеров) тотальный потомственный вирус, состоящий главным образом из неполного вируса.

Среди исследований рекомбинаций, 'когда используют природные штаммы вируса, примерно в соответствии с изложенными требованиями, были проведены эксперименты, описанные Tobita (1971, 1972). Смешанную инфекцию проводили на линии клеток конъюнктивы человека, «лон 1-5С-4 (Kilbourne, 1969), штаммами NWS (H0N1) и Гонконг (H3N2), .которые примерно с равной эффективностью образовывали на этих клетках бляшки. Клоны потомственного вируса случайно выделяли из бляшек, образованных на тех же клетках при отсутствии селектирующего давления; у них определяли серо-ТЙП НА* -и NA*. Данные о частоте появления четырех возможных генотипов среди 191 потомственного клона, полученные в четырех отдельных опытах, приведены в табл. 22.

Полученные таким образом результаты ясно указывают на существование или несуществование рекомбинационных событий среди мутантов. Между мутантами с относительно низким уровнем реверсий и с малой степенью текучести рекомбинации либо происходят с частотой, меняющейся от 2 до 33%, либо не определяются (не превосходят 0,02%)- Мутанты могут быть разбиты на группы, или кластеры, в пределах которых не происходит рекомбинация. Подразумевается, что такая картина рекомбинации имеет место главным образом в результате обмена фрагментами генома. Результаты, полученные Mackenzie (1970), которые он считал указывающими на линейность карты вирусного генома, также совместимы с приведенной схемой. Они показывают, что мутанты разбиваются на пять кластеров, внутри которых рекомбинаций не происходит (за некоторыми исключениями), но между которыми обнаруживаются рекомбинации с частотой более 2%.

Существование внутригенных рекомбинаций, идущих по механизму кроссинговера, в настоящее время не может быть полностью исключено. Но если они происходят так же, как в полиовирусе (Cooper, 1969; Cooper et al., 1971), то при сравнении размеров генома полиовируса и фрагментов РНК вируса гриппа можно получить, что частота таких рекомбинаций не превышает 0,3%. Рекомбинации такого порядка

должны бы легко обнаруживаться при соответствующем подборе its-мутантов. )Пока данные, предполагающие существование внутригенных рекомбинаций, отсутствуют.

Sugiura и соавт. (1972) не обнаружили расхождений между данными по рекомбинации и по 'комплементации. Это поддерживает предположение, -что (Каждый субгеномный фрагмент является моноцистрО'ННым (Skehel, 1972). С другой, стороны, Simpson и Hirst (1968), а также С. Г. Маркушин. и Ю. 3. Гендон (1973) описали определенные комплементи-рующие пары мутантов, рекомбинация между которыми отсутствует. Разночтения между рекомбинацией и комплементацией, предполагающие либо внутригенную комплементацию,, либо присутствие двух генов в одном фрагменте РНК, должны быть разрешены в 'будущих исследованиях.

Нередко частота рекомбинации заметно меняется от опыта к опыту. Для одной и той же пары мутантов при предположительно одинаковых условиях экспериментов различия могут быть в 30 раз (Mackenzie, 1970; Hirst, 1973) или в несколько раз (Sugiura et al., 1972). Согласно данным Mackenzie (1970), добавление к 'культуральной жидкости после адсорбции вируса RDE стабилизирует частоту рекомбинаций.. Он также ввел во все опыты одно и то же стандартное скрещивание и, используя RDE и соотнося наблюдаемую частоту рекомбинации определенной пары с аналогичной величиной, полученной для стандартного скрещивания, смог свести разброс данных « минимуму. Достигнутая таким образом воспроизводимость позволила Mackenzie 'продемонстрировать аддитивность частоты рекомбинации между рядом мутантов и сконструировать линейно организованную карту генома. Однако та же техника не имела успеха в системе, использованной в работе Hirst (1973). В настоящее время окончательно ответить на вопрос, линейно или нет организованы гены, — нельзя.

Другой существенной, постоянно наблюдаемой особенностью рекомбинации является то, что множественность инфекции может быть в значительных пределах снижена без заметного уменьшения частоты рекомбинации (Simpson, Hirst, 1968; Mackenzie, 1970; Sugiura et al., 1972; Hirst, 1973). При множественности каждого вируса, равной '/ю БОЕ/клет-ку, когда только 5% всех зараженных клеток получают сразу оба вируса, частота рекомбинации должна падать до V20 от максимального уровня. Однако в действительности она уменьшается менее чем 'вдвое (Sugiura et al., 1972). Это можно объяснить лишь исходя из предположения о присутствии частиц, которые не являются инфекционными в обычном смысле, но способны приводить к появлению инфекционных рекомби-нантов 'вследствие генетического взаимодействия с другим вирусом (раздел VA, 3).

Рекомбинация между штаммами Lee и Mil вируса гриппа типа В 'была показана в работах Perry и Burnet (1953), а также Perry и соавт. (1954). Они получили рекомбинанты, которые содержали НА* типа Mil, выявляемый по серологической специфичности, термостабильности и сродству к рецептору, но наследовали от штамма Lee патогенность для легких мышей и реципрокные рекамбцнанты, авирулент-ные Lee.

Tobita и Kilbourne (1974) заражали «летки куриного эмбриона штаммом Lee и штаммом В/Массачусетс/1/71, антиген-'но отличным от Lee как по НА*, так и ло NA*, и наугад выделяли бляшки, которые развивались в отсутствие селектирующего давления. В клонах определяли оеротипы НА* и NA*. Изученный 31 клон разбили на следующие типы:

Hi.ee — NLee 3 клона

Hjviass — NMass 8 КЛОНОВ

HLee — NMass 2 КЛОна

Hjviass — NLee . .18 клонов.

Двадцать из 31 клона (64%) являлись рекомбинантами по двум поверхностным антигенам. Таким образом, вирусы гриппа типа В не отличаются от вирусов гриппа типа А в отношении высокой частоты рекомбинации.

Несмотря на эффективную рекомбинацию вирусов внутри как типа А, так и типа В, межтиповых рекомбинантов получить не удается.