3. Определение белка.

Принцип метода основан на коагуляции белка в моче в присутствии азотной (или 20% раствора сульфосалициловой) кислоты.

Ход работы: к 5 каплям мочи добавляют 1-2 капли азотной (или сульфосалициловой) кислоты. При наличии белка в моче появляется мутность.

Таблица. Обнаружение патологических компонентов мочи.

Патологические компоненты мочи Название реакции Принцип метода: Окраска (осадок) Вывод: Глюкоза Кетоновые тела (ацетон) Белок Реакция Троммера Проба Либена Реакция с азотной кислотой Окислительно- восстановительная реакция глюкозы с Cu(OH)2 Образование иодоформа Осаждение белка (денатурация)

Примечание: при наличии в исследуемой моче глюкозы и белка определяют их количественное содержание.

Количественное определение белка в моче колориметрическим методом с пирогаллоловым красным.

Принцип метода: при взаимодействии белка с пирогаллоловым красным и молибдатом натрия образуется окрашенный комплекс, интенсивность окраски, которого пропорциональна концентрации белка в пробе.

Реактивы: Рабочий реагент – раствор пирогаллолового красного в сукцинат-ном буфере, калибровочный раствор белка с концентрацией 0,50 г/л

Ход работы:

Отмерить	Моча	Калибратор	Вода дист.
Моча	20 мкл	─	─
Калибратор	─	20 мкл	─
Вода дист.	─	─	20 мкл
Рабочий реагент	1000 мкл	1000 мкл	1000 мкл

Пробы перемешать, выдержать 10 мин. при комнатной температуре (18 -25ºС). Измерить оптическую плотность опытной (D_оп) и калибровочной пробы (D_к) против контрольной пробы при λ=598 (578-610) нм. Окраска стабильна в течении 1 ч.

Расчет: концентрацию белка в моче (С) г/л рассчитать по формуле:

С= D_оп/D_к×0,50

где: D_оп = D_к= C = г/л.

Нормальные величины: до 0,094 г/л, (0,141 г/сут)

Вывод:

Количественное определение глюкозы в моче глюкозооксидазным методом.

Принцип метода: При окислении D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты (смесь фенола и 4 аминоантипирина - 4ААП) с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию глюкозы.

глюкозооксидаза

Глюкоза + О₂ + Н₂О глюконолактон + Н₂О₂

пероксидаза

2Н₂О₂ + фенол + 4ААП окрашенное соединение + 4Н₂О

Ход работы: в две пробирки вносят по 1 мл рабочего раствора и по 0,5 мл фосфатного буфера. В первую пробирку добавляют 0,02 мл мочи, во вторую – 0,02 мл калибратора (калибровочный, стандартный раствор глюкозы, 10 ммоль/л). Пробы перемешивают, выдерживают 15 мин при температуре 37⁰С в термостате и измеряют оптическую плотность опытной (D_оп) и калиб-ровочной (D_к) проб против рабочего реагента при длине волны 500-546 нм.

Расчет: С = D_оп/D_к  10 ммоль/л D_оп= D_к =

С =

Содержание глюкозы в суточной моче ммоль/сутки определяют, умножая полученный результат на объем собранной за сутки мочи.

Вывод:

Примечание. При содержании сахара в моче более 1% ее необходимо разводить.

В настоящее время в биохимических лабораториях используется унифи-цированный экспресс-метод анализа мочи на глюкозу с помощью реактив-ной бумаги на глюкозу Глюкотест или с использованием комбиниро-ванных тест-полосок на РН, белок, глюкозу, кетоновые тела и кровь. Тест-полоски, опускают в сосуд с мочой на 1сек. и сравнивают окраску по шкале.