36.3. Современные векторные системы

Учитывая, что использование генной терапии в лечении патологии ЦНС встречает ряд препят­ствий, таких как постмитотическое состояние не­рвных клеток и изоляция их гематоэнцефаличес-ким барьером (ГЭБ) [391, важным вопросом яв­ляется создание оптимальных векторов и методов доставки их в головной мозг. Специалистами в области генной терапии определены свойства так называемого «идеального вектора», который дол­жен внедряться в широкий спектр клеток орга­низма-реципиента, эффективно доставлять тера­певтический ген, обеспечивать стабильную эксп­рессию гена после трансфекции, вызывать незна­чительный иммунный ответ, обладать тканевой

специфичностью и быть способным к получению в больших количествах.

На основании данных, приведенных в несколь­ких литературных обзорах [39,46,47], можно дать следующие характеристики векторов, используемых в настоящее время в генной терапии при экспери­ментальной ЧМТ.

Аденовирусный вектор (рис. 36-1) имеет следую­щие преимущества: 1) внедряется в постмитотичес-

Рис. 36-1. Демонстрируется эффективность трапсфекции кле­ток ЦНС собак при помощи аденовирусного вектора, несуще­го ген /?- галактоз ид азы (Ad327 /5-Gal), после интратекального введения (в большую затылочную цистерну). Клетки, секрети-руюшие /3- галактоз ид азу, приобретают голубое окрашивание.

(A) Увеличенная фотография базальной поверхности мозга по­ казывает экспрессию /3-галактозидазы в базальпых цистернах.

2. Микрофотография основной артерии той же собаки, де­ монстрирующая связанное с синтезом /3-галактоз ид азы голу­ бое окрашивание клеток адвентициальной оболочки артерии.

3. На микрофотографии мягкой и паутинной оболочек в об­ ласти сильвиевой щели той же собаки показано обильное голу­ бое окрашивание клеток лептоменинкса, выраженное в боль­ шей степени чем в адвентициальной оболочке основной арте­ рии. (D) Микрофотография основной артерии собаки с экспе­ риментальным субарахноидальным кровоизлиянием демонст­ рирует возможность использования аденовирусного вектора для доставки в ЦНС терапевтических генов при данной патологии; голубое окрашивание видно в адвептициальной оболочке арте­ рии и лептоменингсе (по Stoodley M et al, 2000).

603

Клиническое руководство по черепно-мозговой травме

кие клетки; 2) трансфекция широкого спектра кле­ток и тканей; 3) аденовирусы легко выращиваются в больших количествах; 4) может переносить боль­шие отрезки ДНК. Недостатками его являются ток­сичность, непродолжительный эффект и способ­ность вызывать иммунный ответ с выработкой ан­тител, что ограничивает его повторное назначение.

Для трансфекции трансплантируемых в ЦНС клеток, в частности фибробластов, использовал­ся ретровирусньш вектор, который интегрируется в геном и поэтому обеспечивает стабильную экс­прессию трансгенов. Недостатками его являются: 1) способность инфицировать только делящиеся клетки, в связи с чем ограничена трансфекция ней­ронов; 2) риск туморогенеза; 3) быстрая инакти­вация ретровирусов комплементом.

В связи с многочисленными несоответствиями природных вирусов качествам «идеального векто­ра» изучается возможность использования для ле­чения заболеваний ЦНС новейших смешанных ви­русных рекомбинант, в которых свойства одной вирусной системы сочетаются со свойствами дру­гой с целью улучшения трансфера и экспрессии терапевтических генов.

Среди невирусных векторов в лечении патоло­гии ЦНС наиболее изученным является примене­ние катионных липосом (рис. 36-2). Метод прост, бе-

зопасен, не сопряжен с токсичностью, легко вос­производим и почти не имеет ограничений в отно­шении размеров переносимой ДНК и типа клеток-мишеней. Липосомы готовятся следующим образом. Молекулы катионных (положительно заряженных) липидов смешиваются с молекулами ДНК, имею­щей отрицательный заряд, частично нейтрализуют его, в результате чего образуются положительно за­ряженные комплексы, в которых молекула ДНК находится в центре, а липидньге молекулы — по периферии. Эти положительно заряженные комплек­сы могут связываться с отрицательно заряженной клеточной мембраной, и в результате такого взаи­модействия функционально активные гены эффек­тивно доставляются в клеточную цитоплазму. Недо­статками метода являются низкая эффективность трансфекции in vivo с помощью липосом, которые готовятся с использованием доступных в настоящее время катионных липидов, и неполное понимание механизмов переноса ДНК в клетку.

В то время, как трансфекция клеток-мишеней на молекулярном уровне изучена достаточно ак­тивно, проблема доставки вектора в нервную ткань (vector delivery strategies) часто остается недооце­ниваемым препятствием. Трансваскулярная достав­ка вирусных векторов ограничена наличием ГЭБ и быстрой инактивацией вирусов в кровеносном рус-

Рис. 36-2. Схематическое изображение трансфекции нейронов с помощью катионных липосом. Положительно заряженные липосо­мы частично нейтрализуют отрицательно заряженные молекулы ДНК и образуют положительно заряженные комплексы ДНК/ липиды. Эти комплексы связываются с отрицательно заряженной клеточной мембраной, в результате чего функционально актив­ные гены эффективно достаачяются в клеточную цитоплазму. В последующем клетки, подвергшиеся трансфекции, секретируют белки, в данном случае NGF, которые связываются с мембранами поврежденных нейронов и оказывают нейротрофический эффект (по Yang К. et al.,1997).

604

Генная терапия при черепно-мозговой травме

ле комплементом. Указывается, что повышение проницаемости ГЭБ при ЧМТ может обеспечивать уникальную возможность для применения генной терапии как с использованием вирусных векторов, так и липосом, проникновение которых в непов­режденный мозг ограничено, несмотря на отме­ченную способность пересекать ГЭБ.

С целью повышения проницаемости ГЭБ пред­лагается ряд терапевтических средств, в частности назначение осмодиуретиков, циркуляция которых б крови приводит к «сморщиванию» эндотелиаль-ных клеток. Проницаемость повышается в течение 5—15 минут после инфузии маннитола и нормали­зуется в течение 2 часов. Это приводит к эффек­тивной экспресии трансгенов в базальных гангли­ях и мозговой коре при использовании аденови­русного вектора и вируса простого герпеса. На наш взгляд, использование осмодиуретиков в комплексе лечения повышенного внутричерепного давления при тяжелой ЧМТ может облегчать применение генной терапии. Другим средством повышения про­ницаемости ГЭБ служит использование аналогов брадикинина, в частности RMP-7, инфузия кото­рых приводила в ряде исследований к 12-кратному увеличению поступления терапевтических агентов вЦНС.

Другим способом доставки векторов в нервную ткань может быть их прямое введение в паренхиму головного мозга. Этот метод позволяет избежать пре­пятствия в виде ГЭБ и инактивации комплемен­том, его преимущества — низкая системная ток­сичность и использование небольшого количества вируса. После прямого введения аденовирусов или вируса простого герпеса в мозг трансфекция кле­ток наблюдалась в радиусе 2 мм вокруг места инъ­екции, что весьма значительно для мозга крыс, но не обеспечивает достаточную трансфекцию у че­ловека.

Введение вектора в цереброспинальную жидкость может вызвать экспрессию трансгенов в клетках эпендимы и сосудистых сплетений. Этот метод мо­жет обеспечить секрецию терапевтических белков в ликвор с последующим их проникновением в го­ловной мозг. Прямое введение аденовируса в боль­шую затылочную цистерну приводило также к трансферу генов в лептоменингеальные клетки, окутывающие магистральные артерии, адвентици-альные клетки крупных сосудов и, реже, гладко-мышечные клетки мелких сосудов. По мнению за­рубежных ученых, применение вентрикулярных канюль у больных с тяжелой ЧМТ может быть ис­пользовано для введения комплексов липосомы/ ДНК.

Многообещающим методом является использо­вание нервных стволовых клеток (НСК) в качестве вектора для генной терапии. НСК представляют со­бой постоянный исходный источник клеток не­рвной ткани — нейронов, олигодендроглии, аст-роглии, и предназначены, вероятно, для пополне­ния популяций и субпопуляций клеток мозга в физиологическом (старение) и патологических процессах в организме человека и животного. С момента их открытия известно, что эти клетки яв­ляются «бессмертными», т.к. пополняя популяции нервных клеток, они «самовосстанавливаются» [3,13,42J. Изолированные из тканей мозга НСК продолжают размножаться в условиях культивиро­вания in vitro в бессывороточной среде под воздей­ствием как эпигенетических, так и генетических факторов. В качестве эпигенетических факторов ис­пользуют воздействие на НСК EGF и FGF, а ге­нетическими факторами, которые воздействуют на НСК в условиях in vitro, являются гены v-myc и большой Т-антиген [13, 16, 29, 31, 33].

Важно отметить, что эти клетки, извлеченные из субвентрикулярной зоны головного мозга плода человека, в изолированном состоянии показали способность к дифференцировке в нейрональные и глиальньте клеточные линии, полностью проявив свою мультипотентность [44]. При имплантации мы­шиных клонов НСК в желудочки мозга новорож­денных мышей клетки прививались в субвентрику­лярной герминативной зоне, а затем начинали миг­рировать к обонятельной луковице, превращаясь в нейроны. E.Y. Snyder и соавторы (38) имплантиро­вали также человеческие клоны НСК в боковой желудочек новорожденных мышей, где они интег­рировались в субвентрикулярную зону. Из этой зоны человеческие НСК затем интенсивно мигрировали или вдоль субкортикального белого вещества, или вдоль рострального миграционного тока (rostral migratory stream), как и мышиные НСК. При этом НСК давали такие же дифференцированные кле­точные клоны, как если бы это происходило при нормальном развитии головного мозга человека [22, 36, 38].

Современные исследования при эксперимен­тальной ЧМТ [18] показали, что при введении че­ловеческих нервных клеток-предшественников фе-тального происхождения в мозолистое тело крыс с повреждением в области гиппокампа отмечается от­четливая миграция этих клеток к месту травмы. Боль­шинство клеток, происходящих из этих предше­ственников, демонстрировало иммунореактивность глиальных маркёров, таких как виментин или гли-альный фибриллярный кислый протеин, меньшая

605

Клиническое руководство по черепно-мозговой травме

же часть — нейрональных маркеров, таких как каль-бидин, парвальбумин или МАР2. Авторы считают, что дальнейшие исследования должны быть направ­лены на выяснение сигналов окружающих клеток, стимулирующих дифференциацию клеток—предше­ственников в нейроны in vivo, а также замещение погибших нейронов организма-реципиента. Другие исследователи [26] указывают, что природа таких сигналов в значительной степени распознана. Диф-ференцировка НСК б нейроны определяется кон­тактными и растворимыми факторами. Это слож­ный процесс, требующий взаимодействия между раз­личными клетками в течение нескольких дней. В тка­невых культурах определено, что НСК трансфор­мируются в синаптически активные нейроны под влиянием нейротрофинов, секретируемых глиаль-ными клетками. При взаимодействии нейронов и глии нейротрофины активируют глутаматэргические и GABA-эргические синапсы.

Одним из направлений в использовании НСК является создание «бессмертных» клеточных линий путем генетической трансформации эмбриональ­ных предшественников, в частности с целью ин­дукции синтеза ими факторов роста. Перенос ней-ротрофических факторов клонами НСК в ткани зрелого мозга, встраивание самих клонов в уже су­ществующую цитоархитектонику мозга (рис. 36-3) и продолжительная экспрессия этих факторов в по­врежденных структурах головного мозга сулят боль­шие надежды на положительный эффект в лече­нии таких часто встречающихся заболеваний как тяжелая ЧМТ, болезнь Альцгеймера и болезнь Пар-кинсона [10, 21].

Другими исследованиями было показано, что клетки микроглии и астроглии, а также нейроны, могут возникать из стволовых клеток костного моз­га, являющихся нормальными клеточными ком­понентами костного мозга у взрослых индивидуу­мов. Доказано, что клетки нервной ткани и клетки крови имеют общую стволовую клетку, которая в зависимости от условий внешней среды способна превращаться в головном мозге в нервные клетки, а в костном мозге — в клетки крови. Миграция и дифференцировка клеток костномозгового проис­хождения после их внутривенной, интратекальной или интрапаренхиматозной имплантации (рис. 36-4 и рис. 36-5) в ткани головного мозга свидетель­ствуют о реальной возможности использования их при заболеваниях ЦНС [1, 9, 17, 32].

Трансплантация эмбриональной нервной ткани в головной мозг пациента, наряду со множеством положительных эффектов, имеет также и недостат­ки, заключающиеся в необходимости исследова-

Рис. 36-3. Выживание и интеграция трансплантированных НСК. Модифицированные с помощью ретронирусного вектора НСК крыс, секретирующие NGF, трансплантировались ннтрапарен-химатозно в медиальную септальную область и nucleus basalis magnocellularis. Снимки в темном поле (А и В) — ауторадиог-раммы РН]тимидин-меченьиЫСР-сскретирующихНСК.. Клет­ки мигрировали из места имплантации и интегрировались в ок­ружающую паренхиму мозга (ic-внутренняя капсула, gp-блед-ный шар, ас-передняя спайка; верхушка стрелки на снимке В указывает среднюю линию). (С) В светлом поле срез медиаль­ной септальной области, окрашенный по Нисслю, демонстри­рующий пересаженные клетки (покрыты серебряными грану­лами, указаны стрелками) среди нейронов реципиента (вер­хушки стрелок). (По Martinez-Serrano A. and Bjorklund A.,1998).

ния донорской эмбриональной нервной ткани на носительство ВИЧ, других вирусов и белков-при-онов, не говоря об этических аспектах такой транс­плантации.

Уже сегодня можно предполагать, что пересадка в нервную систему стволовых клеток костного моз­га, взятых непосредственно у больного с тяжелой

606

Генная терапия при черепно-мозговой травме

Рис. 36-4. Красными точками указано распределение стволовых клеток костного мозга, меченых 5-бромо-2-дезоксиуридином (BrdUrd), в головном мозге мышей через 12 дней после инъек­ции их в боковой желудочек (по Kopcn G.C. et al., 1999).

ЧМТ, может способствовать стимуляции процесса восстановления структуры, а затем и функций ЦНС. С помощью аутотранеллантации клеток костного мозга в головной мозг можно будет избежать недо­статков, присущих трансплантации донорской эм­бриональной нервной ткани. В последнее время по­явились сообщения о возможности выделения и последующего использования в терапии заболева­ний ЦНС стволовых клеток кожи и подкожного жира. Это позволяет избежать такой болезненной процедуры как пункция костного мозга и, в случае применения стволовых клеток подкожной жиро­вой клетчатки, получать значительно большее их количество.

Рис. 36-5. Иммуногистохимическая локализация BrdUrd-мече-ных (см. текст к рис.5) стволовых клеток костного мозга в пе­реднем мозге. Гематоксилин-эозиновые (А) и иммуногистохи-мические анти- BrdUrd (В) срезы полосатого тела и бокового желудочка на стороне внутрижелудочковой инъекции. Значи­тельное число донорских клеток обнаруживается в полосатом теле, распространяясь от передней спайки до коры поясной извилины. (С) Микрофотография более латерального участка среза В демонстрирует распространение BrdUrd-меченых ство­ловых клеток в наружной капсуле вдоль путей белого вещества (СС-мозолистое тело, St-полосатое тело, ЕС-наружная кап­сула). (D) Длинной стрелкой указан астроцит в молекулярном слое коры гиппокампа, происходящий из стволовой клетки костного мозга. Клетка помечена антителами к BrdUrd и анти­телами к GFAP (глиальный фибриллярный кислый протеин-маркер астроглии). Короткими стрелками указаны ядра, ме­ченные BrdUrd, верхушками стрелок - BrdUrd-негативные ядра (по Kopen G.C. etal.,1999).