5. Метод фиксации потенциала. Сущность метода. Принципиальная измерительная электрическая схема.
Настоящий прорыв в исследованиях мембран клеток вызвал так называемый метод patch-clamp, который был создан на основе метода внутриклеточного диализа клеток. В настоящее время все электрофизиологические исследования мембран клеток производят при помощи данного метода.
Метод patch-clamp позволяет регистрировать на изолированных клетках их потенциалы, токи или одиночные ионные каналы посредством специальной стеклянной пипетки (patch-пипетки), напоминающей микроэлектрод, но имеющей сопротивление от 2 до 10 МОм в зависимости от типа исследуемых клеток. Кроме того, метод позволяет регистрировать ионные каналы с изолированного кусочка мембраны, который может быть расположен по отношению к отверстию пипетки либо внешней, либо внутренней стороной.
Для исследований методом patch-clamp существует несколько практически одинаковых приборов, которые позволяют в режиме current-clamp (фиксация тока) регистрировать потенциалы клеток и осуществлять их электрическое раздражение, а в режиме voltage-clamp (фиксация потенциала) – измерять суммарные ионные токи клетки или токи через одиночные ионные каналы.
По сравнению с методами микроэлектродной техники и классической фиксации потенциала применение пипетки имеет ряд положительных моментов. Во-первых, техническая поддержка метода позволяет при помощи одного прибора исследовать клетки как в режиме фиксации тока, так и в режиме фиксации потенциала. Во-вторых, метод patch-clamp позволяет изучать мелкие клетки без существенного повреждения их мембран, тогда как даже один микроэлектрод, а тем более – два, существенно повреждают мембрану. Далее, сопротивление утечки микроэлектрод-мембрана не превышает 500 МОм, а при использовании метода patch-clamp и, соответственно, patch-пипетки – более 10 ГОм, что существенно влияет на качество регистрации. Наконец, микроэлектроды имеют сопротивление, достигающее 100 МОм, а patch-пипетки – от 2 до 10 МОм, что позволяет не только качественно регистрировать потенциалы и токи клетки, но и вводить в клетки без особых проблем любые соединения.
На рисунке показаны различные конфигурации patch-clamp по отношению к клетке или фрагменту ее мембраны. Сначала пипетку подводят вплотную к мембране изолированной клетки (см. рис. 2, а) и создают в ней небольшое отрицательное давление (см. рис. 2, б). Это приводит к тому, что мембрана плотно закупоривает отверстие пипетки, и формируется высокоомный контакт – конфигурация cell-attached или, иначе, переход пипетка-мембрана с сопротивлением утечки более 1 ГОм. После нормализации давления в пипетке конфигурация cell-attached близка к физиологической ситуации, поскольку зона мембраны, захваченная пипеткой, с внутренней стороны контактирует с внутриклеточной жидкостью, а с внешней стороны – со стандартным внеклеточным раствором, которым заполняют patch-пипетку. Эта конфигурация, с одной стороны, позволяет регистрировать одиночные ионные каналы под пипеткой, а с другой – является промежуточной для других конфигураций. Она позволяет изучать на одиночном канале роль вторичных мессенджеров, которые включаются через рецепторы плазматической мембраны.
Конфигурация cell-attached позволяет сформировать другую конфигурацию, называемую inside-out patch. К ее образованию приводит резкое отрывание пипетки от клетки (см. рис. 2, в). В этом случае на пипетке находится лишь фрагмент мембраны, внутренняя сторона которой смотрит в омывающий раствор перфузионной камеры, а внешняя контактирует с содержимым пипетки. Данную конфигурацию используют для изучения вклада соединений цитоплазмы в канальную активность.
Конфигурация cell-attached позволяет двумя путями (в зависимости от задач исследователя) сформировать конфигурацию, называемую whole-cell. В одном случае для ее получения в пипетку необходимо резко и одномоментно подать небольшое отрицательное давление, разрывающее мембрану под пипеткой и образующее путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке. При этом в мембране возникает дырка, величина которой позволяет осуществлять обмен ионов и различных соединений между пипеткой и цитоплазмой (см. рис. 2, г). В другом случае низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке формируется благодаря влиянию соединений, находящихся в пипетке и вызывающих образование в мембране пор, проницаемых для ионов, но не для молекул. Это перфоративный (perforated) patch. Эта методика позволяет исследовать ионные токи, протекающие через мембрану, идентифицировать и вычленить их.
Конфигурация whole-cell позволяет сформировать еще один вариант конфигурации – outside-out patch (см. рис. 2, д). Медленное оттягивание пипетки от клетки заставляет мембрану растягиваться до тех пор, пока она не отделится от клетки и не сошьется.
Теперь ее внутренняя часть будет контактировать с раствором в пипетке, а внешняя – с омывающим раствором в перфузионной камере. Данную конфигурацию применяют для изучения вклада соединений внешней среды клетки в активность единичных каналов.
