Лабораторные тесты

I. Анализ тромбоцитов.

а). Подсчет тромбоцитов.

Кровь для подсчета тромбоцитов лучше исследовать в течение 12-24 часов после взятия. Наиболее предпочтительный стабилизатор – ЭДТА (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Подсчет с помощью автоматизированных счетчиков легкий, достаточно достоверный. Неточности могут быть при тенденции тромбоцитов к агрегации, при наличии очень крупных тромбоцитов (например, у кошек), что превышает возможности счетчика и ведет к исключению этих тромбоцитов из подсчета. Небольшие частички (липидные капли при липемии, фрагменты клеток, микронормоциты при железодефицитной анемии), наоборот, могут быть сосчитаны как тромбоциты.

В качестве альтернативы можно провести непосредственный подсчет тромбоцитов в крови в камере с использованием фазово-контрастной приставки.

б). Метод подсчета тромбоцитов в мазке крови по методу Фонио.

После обычного приготовления и окрашивания мазка (методом Романовского-Гимза) ведут подсчет тромбоцитов при 100-кратном увеличении микроскопа.

В мазке крови подсчитывают количество тромбоцитов по отношению к 1000 эритроцитов. Зная абсолютное число эритроцитов в 1 литре крови, вычисляют количество тромбоцитов.

в). Морфология тромбоцитов.

Следует провести анализ мазков крови на форму тромбоцитов, их размер и агрегацию.

Большое количество крупных тромбоцитов свидетельствует об активном тромбопоэзе и активном костном мозге. Для объективной оценки определяют средний объем тромбоцитов (MPV). В норме тромбоциты имеют диаметр 1,5-3 мкм. Более крупные тромбоциты обладают большей функциональной активностью, что может служить объяснением отсутствия кровотечений у некоторых собак с тромбоцитопенией. Гигантские формы тромбоцитов характерны для некоторых тромбоцитопатий.

Об активации тромбоцитов также свидетельствует наличие у них псевдоподий и неровная форма.

II. Тесты на функцию тромбоцитов.

1. Время кровотечения.

Тест выполняют на поверхности слизистой оболочки верхней губы (у собак). В норме кровотечение должно прекратиться в пределах 5 минут. Время кровотечения можно определить, очень коротко обрезав когти (время кровотечения надкогтевой пластинки), но этот метод менее точен.

Время кровотечения удлиняется при тромбоцитопении и обычно не меняется при коагулопатиях, таких как гемофилия, поскольку кровотечение вначале прекращается в предполагаемое время вследствие образования тромбоцитных пробок. Из-за отсутствия стабилизации тромбоцитной пробки фибриновыми нитями в месте разреза может начаться повторное кровотечение.

2.Тест на ретракцию сгустка.

После образования сгустка в пробирке с кровью её держат при температуре 370С. Проверка образца через час должна выявить сыворотку, выдавленную из сгустка путем сокращения тромбоцитов и, таким образом, сыворотка размещается между сгустком и стенкой пробирки.

Аномальный лизис (например, лизис сгустка в течение суточной инкубации при температуре 370С) предполагает повышенную фибринолитическую активность. Ложное повышение ретракции (увеличенный объем ретрагированной сыворотки) отмечают при анемии. Недостаточная ретракция кровяного сгустка выявляется при выраженной тромбоцитопении, некоторых формах тромбоцитопатий, а также при эритремии и симптоматических эритроцитозах. В норме ретракция сгустка занимает не более часа.

На результаты тромбоцитарной функции могут повлиять некоторые препараты. Это кортикостероиды, нестероидные противовоспалительные препараты, фуросемид, синтетические пенициллины, цефалоспорины, эстроген, гепарин и др. в связи с этим, данные тесты надо проводить через 4-5 дней после прекращения приема препарата.

III. Показатели коагуляционного гемостаза.

1. Время свертывания цельной крови.

На цельной крови наблюдают время возникновения сгустка крови. Норма составляет менее 7 минут. Этот метод характеризует общую коагуляционную активность крови, уменьшение времени свертывания крови наблюдается при ее повышении. Увеличение – при дефиците прокоагулянтов (наследственные или приобретенные коагулопатии), наличии в крови ингибиторов прокоагулянтов, передозировке гепарина. Несвертываемость крови бывает при врожденной афибриногенемии, в фазе гипокоагуляции острых форм ДВС-синдрома.

2. Протромбиновое время по Квику.

В цитратную плазму добавляется большое количество тромбокиназы и ионов кальция, и замеряется время до обнаружения первых фибриновых нитей. При нормальном содержании фибриногена протромбиновое время плазмы крови отражает уровень факторов протромбинового комплекса (I, II, V, VII, X).

Определение. В пробирку Квика или шприц объемом 5 мл надо набрать 0,5 мл 0,1-молярного раствора оксалата натрия или 0,1-молярного раствора цитрата натрия, наполнить кровью непостредственно из иглы до отметки 0,5 мл, сразу перемешать и центрифугировать.

В подогретую на водяной бане до 37⁰С пробирку Квика набирают 0,1 мл раствора цитратной плазмы. Через 20 секунд добавляют 0,2 мл предварительно подогретого кальциево-тромбопластинового раствора. Включается секундомер до появления первых фибриновых нитей. 100%-ное значение протромбинового времени находится между 11 и 16 секундами.

3. Частичное (парциальное) тромбопластиновое время служит для определения дефицита плазменных факторов свертывания крови (I, II, V, VII-XII).

Определение. К 0,1 мл цитратной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси каолина в 0,5% растворе трис-буфера (рН 7,2). Выдержать 6 минут при 370С (термостат). Время наступления свертывания в норме 10-14 секунд.

4. Тромбиновое время (тест на концентрацию нормального фибриногена). Служит для тестирования главной (второй) фазы свертывания крови, т.е. для определения II, V и X факторов.

Определение. 0,2 мл цитратной плазмы нагреть до 370С и, добавив 0,2 мл раствора тромбина (нагретого до 370С) установить время наступления свертывания. Норма 13-20 секунд.

Тромбиновое время удлинняется при недостатке фибрина, применении антикоагулянтов (гепарин, кумарин), ДВС-синдроме.

5. Определение фибриногена.

Фазовый тест для третьей фазы свертывания крови, то есть для определения фактора I. Определение лсуществляется фотометрически, для чего берется не менее 0,5 мл плазмы, или путем селективного осаждения с последующей рефрактометрией по Шальму.

Метод Шальма. Две микрогематокритные трубочки с цельной кровью отцентрифугировать и определить значение гематокритной величины. Затем определяить содержание белка плазмы рефрактометрически в одной трубочке. Вторую трубочку на 1 минуту поставить в водяную баню при температуре 56-580С, опять центрифугировать 5 минут, затем определить белок плазмы. Различие между показателями общего белка первой и второй трубочек соответствуют количеству фибриногена в плазме. Норма составляет 3-4 г/л. Резкое уменьшение содержания фибриногена наблюдается при коагулопатиях потребления (ДВС-синдром), тяжелых заболеваниях печени.

6. ACT-Test – время активизации коагуляции (гепариновое время).

Этот несложный тест характеризует общую коагуляционную активность крови. Он служит для проверки внутренней антианемической системы и предназначается для контроля состояния системы свертывания крови животных, получающих гепарин.

Норма составляет 11-16 минут. Уменьшение гепаринового времени наблюдают при дефиците антитромбина III. Увеличение – при коагулопатиях, повышенной активности природных антикоагулянтов, лечении гепарином.

7. Определение продуктов деградации фибрина (иммунологический тест). Повышение в плазме крови продуктов деградации фибрина происходит при ДВС-синдроме, массивных тромбозах, инфаркте миокарда, эмболии легочной артерии, а также при лечении препаратами, стимулирующими фибринолиз (стрептокиназа и др.).

8. Фактор Виллебранда.

Иммунологические анализы на фактор Виллебранда используется для диагностики болезни Виллебранда. Заболеваемость болезнью Виллебранда у собак некоторых пород (например, доберман-пинчер, эрдельтеръер) достаточно высока, так что любая склонность к кровотечению и необходимость хирургического вмешательства являются достаточными показаниями для пробы на фактор Виллебранда.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - Аденозина дифосфат

АСТ тест - тест активированного времени свертывания АСТ (activated clotting time)

ДВС синдром – синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови

ИТП - идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура

ПДФ - продукты деградации фибрина/фибриногена

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Кондрахин И. П., Архипов А. В., Левченко В. И. и др. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики. – М.: КолосС, 2004 – С. 43-63.

2. Козловская Л.В, Мартынова М.А. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. – М.: Медицина, 1975 – С.41-43.

3. Васильев М.Ф., Воронин Е.С., Дугин Г.Л. и др. Практикум по клинической диагностике болезней животных. Учебник. – М.: КолосС, 2004, С.202.

4. Романова А.Ф., Выговская Я.И., Логинский В.Е. и др. Справочник по гематологии. – Ростов-на Дону: Феникс, 2000 – С. 253-362.

5. Щербаков Г.Г, Коробов А.В., Анохин Б.М. Внутренние болезни животных. – М.: Лань, 2002 – С. 364-367.

6. Харальд Т, Хайнц Д, Торстен Х. Атлас по гематологии. – М.: Медпресс-информ, 2010 – С. 27, 174-180.

7. Ниманд Х.Г. Болезни собак. – М.: Аквариум, 2004 – С. 450-473.

8. Бажибина Е.Б., Коробов А.В., С.В. Середа. Методологические основы оценки клинико-морфологических показателей крови домашних животных. – М.: Аквариум, 2004 – с.67-76.

9. Уша Б.В., Беляков И.М., Пушкарев Р.П. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных: - Учебник.- М.: КолосС, 2004 – 487 с.

10. Льюис С.М., Бэйн Б, Бэйтс И. Практическая и лабораторная гематология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009 – С. 61, 69-72, 82, 98, 348-403, 431-485.

11. Андерсон Ш.К., Поулсен К.Б. Атлас гематологии. – М.: Логосфера, 2007 – С. 129–140.

12. Риган В., Сандерс Т, Деникола Д. Атлас ветеринарной гематологии. – М.: Аквариум ЛТД, 2000. – С. 90-94.

13. Уиллард Э., Уиллард М, Тведтен Г, Торнвальд Г. Лабораторная диагностика в клинике мелких домашних животных. – М.: Аквариум, 2004. – С. 88-106.