19. Центральные и периферические органы иммунной системы.

Центральные органы иммунной системы - костный мозг и тимус. В них из стволовых кроветворных клеток лимфоциты дифференцируются в зрелые неиммунные лимфоциты, так называемые наивные лимфоциты.

Кроветворный костный мозг - место рождения всех клеток иммунной системы и созревания В-лимфоцитов (В-лимфопоэз).

Тимус (вилочковая железа) отвечает за развитие Т-лимфоцитов: Т-лимфопоэз (реаранжировка, т.е. перестройка генов TcR, экспрессия рецепторов, и т. д.). В тимусе отбираются Т-лимфоциты (CD4 и CD8) и уничтожаются высокоавидные к собственным антигенам клетки. Гормоны тимуса завершают функциональное созревание Т-лимфоцитов, повышают секрецию ими цитокинов.

Родоначальницей всех клеток иммунной системы является кроветворная стволовая клетка. Из лимфоидных стволовых клеток образуются предшественники Т- и В - клеток, которые служат источником Т- и В- популяций лимфоцитов. Т - лимфоциты развиваются в тимусе под влиянием его гуморальных медиаторов (тимозин, тимопоэктин, тиморин и др.).

В дальнейшем тимусзависимые лимфоциты расселяются в периферических лимфоидных органах и трансформируются. Т1 - клетки локализуются в периартериальных зонах селезенки, слабо реагируют на действие лучистой энергии и являются предшественниками эффекторов клеточного иммунитета, Т2 - клетки накапливаются в перикортикальных зонах лимфоузлов, высокорадиочувствительны и отличаются антигенреактивностью.

Периферические линфоидные органы и ткани (лимфатические узлы, лимфоидные структуры глоточного кольца, лимфатические протоки и селезенка) - территория взаимодействия зрелых неиммунных лимфоцитов с антигенпрезентирующими клетками (АПК) и последующей антигензависимой дифференцировки (иммуногенеза) лимфоцитов. В эту группу входят: лимфоидная ткань, ассоциированная с кожей (Scin-Assoelated Lymphoid Tissue SALT); лимфоидная ткань, ассоциированная со слиэистыми оболочками (Mucosus-Associated Lymphoid Tissue - MALT), желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового трактов (солитарные фолликулы, миндалины, пейеровы бляшки и др.). Пейеровы бляшки (групповые лимфатические фолликулы) - лимфоидные образования стенки тонкой кишки. Антигены проникают из просвета кишки в пейеровы бляшки через эпителиальные клетки (М-клетки).

19. Общая характеристика Т- и В- лимфоцитов.

20. Иммунный ответ: гуморальный и клеточный иммунный ответ.

21. Регуляция иммунного ответа. Иммунологическая память и толерантность.

22. Антитела: структура, классы, типы и свойства иммуноглобулинов.

23. Возрастные особенности иммунитета. Особенности иммунитета при бак­териальных, вирусных, грибных, протозойных инфекциях.

24. Иммунопатология. Иммунодефицитные состояния, оценка иммунного статуса.

25. Аллергия и аллергические реакции. Аутоиммунные процессы.

19. РА.

Антигены – генетически чужеродные вещества (белки), которые при попадании в организм вызывают ответную реакцию – продуцирование организмом антител. Антигены бывают корпускулярные (молекулы), клеточные (бактерии, эритроциты) и растворимые (молкулярно-дисперсионные). Антигены имеют рецепторы для связывания со специфическими антителами, как в организме (invitro), так и в пробирке (invivo). Антигенной активностью обладают не только полноценные антигены (белки), но и гаптены (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс и др.). Антитела – высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины). По феномену взаимодействия антигена с антителом выделяют реакции осадочные, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в данных реакциях: агглютинины – вызывают агглютинацию и осаждение комплекса; преципитины – образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участвуют бактериолизины и гемолизины (лизируют антиген). Нейтрализующие антитела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие антигена. При постановке серологических реакций один из компонентов всегда известен. Компоненты разводят на физиологическом растворе. РА является серологической (serum - сыворотка). В основе всех серологических реакций лежит специфическая реакция между антителом и антигеном. Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки (со специфическими антителами) к равномерной взвеси антигена происходит их склеивание 106 (глыбки, комочки, хлопья), постепенно оседают на дно пробирки, формируя агглютинат, жидкость над ним просветляется (рисунок 69). Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический Оантиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16-22 ч. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА. Для определения антител (по известному антигену) берут 5-10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и препроводительным письмом отсылают в лабораторию. Используют свежие сыворотки без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или Рисунок 69 - Реакция агглютинации. 107 живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства. Если же необходимо идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры - смыва с МПА. Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подлогов ленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают и ампулы и запаивают. Нередко диагностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором. Постановка РА классическим (пробирочным) методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции производят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Например, для диагностики бруцеллеза сыворотки разводят 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Удобно разведения производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки - 1:25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с добавлением 2,4 мл физ.раствора. В опытные пробирки разливают по 1 мл физ.раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1:50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1:100), из второй 1 мл - в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы и каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки. Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд. микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4-6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14-16 ч. При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорово- 108 го животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном. Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации. Учет РА проводят невооруженным глазом, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов: ++++ (#) - полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат в виде перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной; +++ ( ) - неполное просветление жидкости, характер агглютината, как и в предыдущем, в виде зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки; ++ ( ) - обозначают РА неполную, с неполным просветлением жидкости, агглютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная; + - наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность; - (минус) - вся жидкость в пробирке мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встряхивании разбивается в равномерную муть. 3-4 креста - положительная РА; 2 креста – сомнительная; 1 крест или его отсутствие – отрицательный результат.

Капельный (пластинчатый) метод РА используют для быстрого обследования поголовья животных в лаборатории и в условиях хозяйства (рисунок 70). На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой исследуемую сыворотку по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего количества сыворотки. Условно считают, что 109 сыворотка в первой капле соответствует разведению 1:50, во второй - 1:100, в третьей - 1:200, в четвертой - 1:400. Через 2-3 мин производят учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают высоко над пламенем горелки. Положительный результат проявляется образованием в капле сыворотки комплекса антиген-антитело в виде крупинок, хлопьев, жидкость становится прозрачной. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Кровяно-капельный метод РА чаще применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответствующего антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный гематоксилином. В положительных случаях РА через 30-60 с. в капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Кольцевую пробу (реакцию) с молоком используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинационные пробирки наливают по 2-3 мл свежего цельного молока и добавляют антиген (окрашенный гематоксилином) по 0,2 мл (2 капли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают в водяной бане при 37 °С 45-60 мин. Если в молоке имеются антитела, образуется комплекс антиген-антитело, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем единиц (рисунок 71).

Реакция Кумбса. Прямая реакция Кумбса заключается в том, что к эритроцитам больного животного добавляют специфическую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции Кумбса сыворотку больного животного соединяют с эритроцитами здорового, а затем добавляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие антитела соединяются с эритроцитами и добавленная антиглобулиновая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антигенами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных блокирующими антителами.

19. РП.

РП - от лат. praecipilo осаждать. При соединении антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами) образуется осадок (преципитат). Используют антигены растворимые, получаемые путем экстракции из разрушенных бактерий или извлеченные из тканей. Постановку реакции осуществляют в пробирках Уленгута. Реакция кольцепреципитации (по Асколи). В качестве антигена служит фильтрат живой или убитой нагреванием микробной культуры или экстракт из исследуемого материала (выдерживают в течение суток и фильтруют до полной прозрачности). В качестве антитела используют специфическую сыворотку фабричного производства. В узкие пробирки Уленгута наливают 0,3-0,4 мл сыворотки (антитела). Антиген осторожно наслаивают по стенке пробирки в объеме 0,3-0,4 мл. Нельзя допустить перемешивания! При положительном результате на границе двух жидкостей образуется белое кольцо (преципитат - осадок). Реакция диффузной преципитации (РДП).В слое агарового геля делают несколько лунок, в которые наливают антигены и сыворотки так, чтобы они находились соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля во все стороны от каждой лунки. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации (рисунок 21), которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля. Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка негомологичны, полосы преципитации не образуется. Предварительный учет результатов РДП производят через 8-10 часов, основной - через 24 и окончательный - через 48 часов (рисунок 73). Реакция флокуляции (по Рамону) (от лат. f1оecus - хлопья) - появление опалесценции или хлопьевидной массы в пробирке при реакции токсин – антитоксин (рисунок 74). Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. В пробирки, содержащие по 10 мл определенного токсина, добавляют убывающее количество специфической токсину антитоксической сыворотки (1,0; 0,9; 0,9; 0,8 и т.д.). Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Через определенное время наблюдается опалесценция, помутнение, выпадает осадок. Это инициальная флокуляция, сначала она появляется в отдельных пробирках, а затем и в соседних с ними.

19. РСК.

Сущность РСК заключается в том, что при внесении в пробирку бактериолитической системы - трех компонентов (антигена, специфического антитела и комплемента) происходит связывание комплемента комплексом антиген + антитело. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу, связывание комплемента не наступает, и он остается свободным. Видимых изменений в пробирке в бактериолитической системе не отмечают ни в случае связывания, ни в случае отклонения комплемента. Поэтому в дополнение вводят в качестве индикатора гемолитическую систему - эритроциты барана и специфический гемолизин против последних (сыворотка кролика, иммунизированного против эритроцитов барана). Если в бактериолитической системе комплемент связался (положительный результат), гемолиза эритроцитов не произойдет, т.к. гемолизин может лизировать эритроциты лишь с помощью комплемента. Если в первой системе не произошло связывания комплемента (отрицательный результат), то наступает гемолиз эритроцитов, т.к. оставшийся свободным комплемент используется гемолизином для осуществления своей гемолитической функции (рисунки 75, 76).

Компоненты реакции: I. Бактериолитическая система

1. Антитела - исследуемые сыворотки (присылают из хозяйств от обследуемых животных), они должны быть свежими, прозрачными, негемолизированными, допустимо использовать консервируемые. Сыворотка предварительно инактивируется 30 минут при 36°С для разрушения собственного комплемента;

- диагностические сыворотки (положительная бруцеллезная и отрицательная сыворотки крови) их готовят на биофабриках.

2. Антиген – биофабричный бруцеллезный антиген единый для РА, РСК и РДСК – гомогенная 10 млрд. взвесь инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в физиологическом растворе.

3. Комплемент – неспецифическая сложная многокомпонентная система термолабильных белков крови, фактор литического действия, содержащийся в свежей сыворотке крови любого животного и человека, а в наибольшем и более постоянном количестве – в сыворотке крови самцов морской свинки. Активируется при наличии комплекса антиген-антитело. Отдельно с антигеном или антителом не взаимодействует. В ходе реакции антиген-антитело-комплемент образуются компоненты разрушающие клетку (бактериальную, соматическую и др.), которая является антигеном. Такое разрушение антигенов под влиянием антител и комплемента называется иммунным лизисом. Используют комплемент, полученный в лаборатории или биофабричный (жидкий либо лиофильно высушенный). В связи с тем, что для постановки РСК комплемент берут в строго определенных количествах, только на одну систему, его предварительно титруют. При избытке комплемента, он может участвовать в обеих системах реакции, что приведет к ошибке в постановке диагноза. II. Гемолитическая система

4. гемолитическая сыворотка – гемолизин – сыворотка кролика, гипериммунизированная эритроцитами барана, содержащая антитела к этим эритроцитам. Для этого кролику 4-5 раз с интервалом 2-3 дня вводят эритроциты барана, после последней инъекции берут сыворотку и используют. Гемолизин выпускают в жидком и или сухом виде. Гемолизин обладает свойством лизировать эритроциты барана, но только в присутствии комплемента.

5. Эритроциты барана являются антигеном для гемолизина в гемолитической системе. Кровь от барана получают в стерильный флакон, дефибринируют стеклянными или фарфоровыми бусами, продолжая встряхивать еще 10 минут после кровопускания. Фильтруют, центрифугируют 10-15 минут. Отмывают эритроциты не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Из осадка готовят 2,5 % взвесь эритроцитов, которую и используют для постановки РСК. Реакцию ставят в строго определенной последовательности: сначала вносят компоненты баксиситемы (антиген + антитело + комплемент) и помещают на водяную баню при 37 °С на 20 минут, затем вносят гемолитическую систему (гемолизин + эритроциты барана) и повторно помещают на водяную баню при 37-38 °С на 20 минут. Компоненты реакции перед постановкой РСК титруют и вносят в пробирки в объеме 0,2 мл. Результаты РСК оцениваются по пяти бальной шкале (рисунок 77):

++++ -полная задержка гемолиза; +++ - значительная, но неполная задержка гемолиза; ++ - частичная задержка гемолиза; + - значительная задержка гемолиза; - полный гемолиз. 4 и 3 креста - положительный результат; 2 креста - сомнительный, 1 крест и отсутствие крестов - отрицательный. Предварительный учет проводят по истечении срока выдержки на водяной бане, окончательный – через 18 – 20 часов.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Бактериолитическую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешивания компонентов – при комнатной температуре 15 мин., затем на холоде 4С 20 часов и на водяной бане 15 мин. затем добавляют гемолитическую систему, помещают на водяную баню и проводят учет реакции. Считается более эффективной, чем РСК.

19. РН.

Реакция нейтрализации.В пробирке соединяют равные объемы сыворотки крови и бактериальной взвеси, и после выдержки определяют, сохранился ли в 118 смеси возбудитель путем заражения смесью, чувствительной к взятому антигену живой системы (биопроба на тест-объектах)

Отсутствие действия возбудителя на тест-объект (отрицательная биопроба) при положительном контроле расценивается как свидетельство нейтрализации биологической активности антигена антителами сыворотки и, следовательно, гомологичности антител сыворотки и антигенов возбудителя. В случае же положиРисунок 78 - Реакция нейтрализации (РН). 119 тельной биопробы считают, что нейтрализации не произошло, т.к. сыворотка не содержит антител к взятому возбудителю.

19. МФА.

Метод флуоресцирующих антител. При постановке данной реакции используют люминесцентный микроскоп. Антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные противовирусные сыворотки, максимально освобожденные от гетероантител. Из таких сывороток выделяют гомогенные фракции, содержащие антитела, которые метят флуорохромом. Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом. Используют мазки, отпечатки, гистосрезы и культуры клеток . Мазки готовят из смывов и других жидкостей. Мазки-отпечатки готовят из тех органов и тканей, в которых предполагается наибольшая концентрация возбудитеРисунок 79 - Люминесцентный микроскоп. 120 ля. Из органов готовят отпечатки, прикладывая быстрым движением предметное стекло к поверхности органа. Отпечаток должен быть тонким и равномерным. Мазки-отпечатки подсушивают на воздухе, затем фиксируют и сохраняют в холодильнике до исследования (при минус 4°С, минус 70°С). Для контроля таким же образом готовят препараты из органов здоровых животных. Непосредственно на препарат наносят конъюгат и выдерживают в течение 20-60 мин при температуре 37 °С во влажной камере, некоторые исследователи предпочитают проводить эту процедуру при 4 °С, удлиняя время. Препараты отмывают физиологическим раствором (рН 7,2-7,5) от не связанного с антигеном конъюгата. Затем их подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом. Результаты учитывают по интенсивности и специфичности флуоресценции исследуемого объекта с учетом структурных особенностей по следующей шкале (рисунок 80): (++++) - яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета; (+++) - яркая флуоресценция зеленого цвета; (++) - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета; (+) - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета; (-) - объект не флуоресцирует.

19. ИФА

Иммуноферментный анализ. Это методы, основанные на использовании в качестве метки антигенов и антител ферментов. ИФАаналогична МФА, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, и учет результатов реакции проводят не под люминесцентным микроскопом, а под обычным световым. Рисунок 80 - Свечение вируса при РИФ. 121 При выявлении антигена с помощью этого метода используют конъюгаты, полученные из антител, выделенные из специфической сыворотки, и фермент. На мазок наносят 0,2-0,3 мл иммунопероксидазного конъюгата. Инкубируют 1-2 ч при 37 °С во влажной камере. Препарат в течение 15 мин тщательно промывают физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Наносят на него несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5-10 мин и промывают 10-15 мин в физиологическом растворе, споласкивают дистиллированной водой. В положительных случаях, т.е. при наличии антигена в исследуемом препарате, после нанесения иммунопероксидазного конъюгата образуется комплекс антиген-антитело, меченный ферментом. После нанесения на препарат раствора субстрата последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видный в световом микроскопе.Результаты учитывают с помощью светового микроскопа. Субстрат под действием фермента разлагается, образуя продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.