19. Изучение действия антибиотиков, антисептиков и бактериофагов на микроорганизмы

В настоящее время есть много антибиотиков, имеющих свой антимикробный спектр действия. Чувствительность микробов к антибиотику может снизиться или совсем исчезнуть за счет появления резистентных вариантов у данного вида микроба. Поэтому при назначении антибиотиков больным необходимо определить степень чувствительности к ним возбудителя с целью подбора самого эффективного средства.

Метод диффузии антибиотиков в агар с применением дисков

Метод основан на формировании зоны задержки роста микроорганизмов вокруг бумажного диска, пропитанного антибиотиком, на плотной питательной среде. Биологическая промышленность выпускает диски из фильтровального картона диаметром 6 мм, пропитанные растворами антибиотиков определенной концентрации. Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету картона или кода, который представляет собой две-три буквы из названия антибиотика, вытесненные на диске. Диски фасуют во флаконы по 100 штук. Учитывая гигроскопичность некоторых антибиотиков, на дно флакона помещают силикагель, вещество, быстро поглощающее влагу и меняющий при этом свою окраску с синей на розовую. Изменение цвет силикагеля является показателем присутствия влаги во флаконе. Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в розовый цвет, использовать нельзя. После вскрытия флаконов диски можно хранить в условиях холодильника в течение срока. Указанного на этикетке набора. Перед использованием флаконы с дисками необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа для предотвращения образования конденсата на внутренней поверхности флаконов. Для получения достоверных результатов используют стандартные среды, диски и условия проведения исследования.

Для определения чувствительности применяют следующие питательные среды:

- среда АГВ (Андреева, Гивинталь, Гриднева, Ведьмина) – сухая готовая среда, в состав которой входит питательный бульон, порошок агара, лизат кормовых дрожжей, крахмал растворимый, натрия фосфат двузамещенный;

- диагностический агар ДОИ – рекомендованная ВОЗ сухая готовая среда. Для микроорганизмов, не растущих на обычных питательных средах, в среды добавляют 5 % дефибринированной крови. Расплавленные среды разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Глубина агарового слоя в чашках должна составлять 3-4 мм. После застывания агара их подсушивают при комнатной температуре 30-40 минут с приоткрытыми крышками. Готовые чашки со средой можно хранить при 10 °С не более 7-10 дней. Для посева используют 12-20 часовые агаровые культуры исследуемых микробов, которые смывают физиологическим раствором и по стандарту мутности готовят одномиллиардную взвесь. Для посева можно использовать также чистую 20- часовую бульонную культуру. На поверхность питательной среды наливают 1 мл взвеси культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности. Излишек жидкости отсасывают пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Диски с различными антибиотиками раскладывают стерильным пинцетом на поверхность засеянной среды на одинаковом расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков для диффузии антибиотиков в агар чашки выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем помещают в термостат при 37 °С вверх дном. Результаты учитывают через 16-18 часов по величине зоны задержки роста микробов вокруг диска (рисунок 62). Чашки помещают вверх дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45 °. Определяют диаметр зоны с помощью линейки, штангенциркуля или миллиметровой бумаги с учетом диаметра самого диска, с точностью до 1 мм. При диаметре зон в 15-25 мм микробы следует считать чувствительными к антибиотику, при зоне до 15 мм – малочувствительны, отсутствие зон задержки роста указывает на нечувствительность культуры к данному антибиотику. При не резко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру, не принимая во внимание мелкие колонии или едва заметный газон у края колонии.

Метод серийных разведений антибиотика Сущность данного метода заключается в выявлении роста исследуемой культуры в питательной среде, содержащей разные концентрации антибиотика.

Метод серийных разведений позволяет определить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост изучаемого микроорганизма.

При выборе питательной среды учитывают, что она должна обеспечить оптимальный рост исследуемой культуры микроба. Чаще всего применяют МПБ; бульон Хоттингера, с содержанием 180-200 мг % аминного азота; 2 % МПА. Для исследования анаэробных бактерий используют среду Китта-Тароцци без кусочков печени с добавлением 0,5 % глюкозы. Для серийного разведения антибиотика в пробирки наливают по 2 мл среды для аэробов и по 9 мл среды для анаэробов. Из каждого антибиотика готовят два раствора – основной, а из него уже рабочий. Используют агаровые 16-18 часовые культуры, которые смывают физиологическим раствороми по стандарту мутности готовят одномиллиардную взвесь в 1 мл. В каждую пробирку с рабочими разведениями антибиотика высевают по 0,2 мл одномиллиардной взвеси микробов. Учет результатов проводят визуально, через 16-18 часов инкубации при 37 °С. Отмечают пробирку, в которой отсутствует рост. Показатель концентрации антибиотика в ней складывают с количеством антибиотика в последующей пробирке, ГД отмечен рост культуры, и выводят среднее арифметическое, которое является показателем бактериостатической концентрации, характеризует чувствительность бактерии к антибиотику и называется минимальной ингибирующей концентрацией (МИК). Если рост отмечен во всех пробирках ряда, то это указывает на устойчивость испытуемого организма к максимально взятой дозе антибиотика. Отсутствие роста во всех пробирках свидетельствует о том, что чувствительность микроба выше использованной в опыте минимальной концентрации