18 . Приготовление питательных сред.

Для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях применяют различные искусственные питательные среды. На них микроорганизмы выделяют, изучают, накапливают и хранят. 51 Питательные среды по своей сущности являются искусственной средой обитания микробов и поэтому должны соответствовать следующим требованиям: - содержать основные питательные вещества, из которых строится микробная клетка: макроэлементы (азот, углерод, водород, кислород, фосфор, железо, калий, кальций, сера, магний), микроэлементы (кобальт, йод, марганец, молибден, цинк, медь и др.), витамины. Все элементы должны находится в легкоусвояемой для конкретного микроорганизма форме. В питательные среды добавляют аминокислоты, органические кислоты, витамины, сахара, многоатомные спирты, белки, соли различных кислот и воду; - иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды), т.к. поступление веществ в микробную клетку осуществляется при помощи диффузии и осмоса; - быть изотоничными, т.е. иметь концентрацию солей соответствующую концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов 0,5 %, для галлофилов – 3 %); - быть нетоксичными для исследуемых микробов; - обладать оптимальной для выращиваемого микроорганизма концентрацией водородных ионов (рН). Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, т.к. от этого показателя зависит проницаемость оболочки микробной клетки. Для большинства микроорганизмов оптимум роста наблюдается при рН 7,2-7,4; - быть по возможности прозрачными, т.к. это облегчает изучение в них роста микробов; - быть стерильными, чтобы была возможность размножать в них культуру только одного вида микроба. Классификация питательных сред Потребность в питательных веществах у различных микробов неодинакова, поэтому нет возможности создать для них универсальную питательную среду. На основании разных показателей питательные среды классифицируют следующим образом. 1. По консистенции: жидкие, плотные, полужидкие; 52 2. По происхождению - животного, растительного происхождения и синтетические среды постоянного состава; 3. По назначению: - обычные (простые) - для выращивания большинства микроорганизмов; - специальные - для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питательных средах; - дифференциально-диагностические - употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, протеолитических, редуцирующих и других свойств); - элективные - для выделения микробов одного рода или вида из материала, содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; - среды обогащения (накопительные). Основой многих питательных сред животного происхождения является мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, освобожденного от костей, фасций, сухожилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1:2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстрагируют 12-24 ч, кипятят 1,5-2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированной воды до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватномарлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Простые питательные среды Мясо-пептонный бульон (МПБ) - жидкая питательная среда (рисунок 38). Для его приготовления к 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой поваренной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, поэтому МПБ подщелачивают – добавляют небольшое количество 10-15 % раствора КОН или NaOH, кипятят 2-3 мин. МПБ фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклавируют. Рисунок 38 - МПБ. 53 Мясопептонный агар (МПА) - плотная питательная среда (рисунок 39). К МПБ добавляют 2 % агар-агара (органическое вещество, полученное из морских водорослей) и кипятят до его расплавления, в горячем виде устанавливают рН, кипятят 5-10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром раскладывают наклонно под углом 5-6°. При застывании образуется скошенная плотная поверхность. Мясо-пептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА но агар-агара добавляют меньше – 0,2 %. Мясо-пептонный желатин (МПЖ). К МПБ добавляют 10-20 % желатина (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горячем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватномарлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. На рисунке 40 представлены различные формы разжижения желатина. Молоко – натуральная естественная питательная среда. Цельное молоко обезжиривают центрифугированием, разводят водой 1:1, устанавливают рН 7,0-7,3 с помощью питьевой силы. Молоко стерилизуют дробно текучим паром 3 дня в автоклаве при 110 °С 20 мин. При изучении редуцирующих свойств микробов пеРисунок 39 - МПА. Рисунок 40 - Формы расщепления желатина. 54 ред стерилизацией добавляют 2 % раствор метиленового синего из расчета 2 мл краски на 100 мл среды. Специальные питательные среды Анаэробы – большая группа микроорганизмов, которые растут и размножаются при отсутствии кислорода воздуха. Анаэробный тип дыхания менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. Для удаления из сред кислорода в них помещают кусочки печени, головного мозга, почек. Тканевые клетки обладают редуцирующими свойствами, т.е. активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Среды в пробирки разливают высоким столбиком в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1-2 см от поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия. Мясо-пептонный печеночный бульон КиттаТароцци - жидкая среда для культивирования анаэробов (рисунок 41). Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют и печеночную воду добавляют к МПБ 2:1 (на 2 л МПБ 1 л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. Сахарно-кровяной агар Цейсслера (специальная обогащенная среда для анаэробов). Готовят 3 % МПА и добавляют 2 % глюкозы и 10-20 дефибринированной крови, подсушивают 4-6 часов в термостате и используют