19. Определение патогенности и вирулентности микроорганизмов

Определение вирулентности микробов

Вирулентность – это биологическое свойство микроба, характеризующее степень патогенности. Это индивидуальный признак, который может усиливаться или ослабляться под влиянием различных факторов. За единицу измерения вирулентности приняты:

- минимальная летальная доза Dlm (dosisletaliminima) – наименьшее число патогенных микроорганизмов, способное вызвать гибель подопытного животного при заражении;

- безусловная смертельная доза Dcm (dosiscetraletalis) – от которой гибнут 100 % зараженных животных;

- LD50 средняя смертельная доза – количество патогенных микробов, способное вызвать гибель 50 % зараженных животных; Чем меньше микробных клеток вызывает гибель лабораторных животных, тем вирулентнее культура микроба.

Токсигенность микроба обусловлена ядовитыми веществами (экзотоксинами), вырабатываемыми некоторыми микроорганизмами – возбудителями ботулизма, столбняка, энтеротоксемии и др. Экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую среду, обладают резко выраженной токсигенностью, избирательностью действия с поражением отдельных органов и тканей. Токсигенность определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, является минимальная смертельная доза (LDm) и средняя смертельная доза (LD50). Бульонную культуру микроба выдерживают в термостате 1-3 недели для накопления токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Фильтрат культуры разводят стерильным 84 физраствором в десятки, сотни, тысячи и миллионы раз.каждую дозу испытывают одновременно на нескольких животных. Подбирают животных наиболее чувствительных к данному токсину.

Определение токсичности микробов Токсичность микроба обусловлена эндотоксина, т.е. ядовитыми веществами, прочно связанными с микробной клеткой и получить их можно только при разрушении микробной клетки. Например, токсичностью обладают сальмонеллы, кишечная палочка (патогенные серовары) и другие микробы.

При определении токсичность используют 1-2 суточную агаровую культуру. Готовят смыв физраствором и по стандарту мутности доводят его до 10 млрд. микробных клеток в 1 мл. Для извлечения токсина микробные клетки разрушают трехкратным замораживанием и оттаиванием. Для обезвреживания неразрушенных клеток взвесь прогревают при 80 °С 20 минут, а затем вводят лабораторным животным внутрибрюшинно. Гибель животных наблюдают через 1-2 часа при судорогах.

Схема диагностики инфекционных болезней

Диагноз на инфекционные болезни ставят комплексно, учитывая эпизоотологические данные, клинические признаки болезни, результаты аллергической диагностики, патологоанатомические изменения в органах и результаты лабораторных исследований.

Методы лабораторных исследований При лабораторной диагностике исследуемого материала на инфекционные болезни используют бактериологический, серологический и молекулярногенетический методы.

Бактериологический метод включает:

- бактериоскопический - применяют с целью изучения морфологических особенностей микроорганизмов (формы, размера, особенностей внутренней структуры, расположения в мазках, подвижности, наличии спор и капсул) их тинкториальных свойств (способности воспринимать ту или иную окраску, отношения к растворам спиртов, кислот, щелочей);

- собственно бактериологический - из патматериала выделяют чистую культуру возбудителя и изучают ее культурально-биохимические свойства;

- биологический (биопроба) – определяют патогенные свойства выделенных культур микробов путем заражения лабораторных животных.

Серологический метод – выявляют специфические антитела в сыворотке крови больных или иммунизированных животных, используя заведомо известный (биофабричный) антиген, или определяют наличие неизвестного антигена с помощью известных диагностических иммунных сывороток. Можно определить вид и тип микроорганизма, выделенного из патматериала. Молекулярно-генетический – использование ПЦР и ДНК-зондов.

Отбор патматериала Для определения или подтверждения причины болезни или гибели животного исследуемый материал отправляют в ветеринарную лабораторию. При отборе материала из органов его поверхность прижигают распаленным шпателем и делают разрез стерильным скальпелем. С поверхности разреза берут материал пастеровской пипеткой или бактериологической петлей и тонким слоем наносят на предметное стекло. Из тканей органов делают мазки-отпечатки. С этой целью стерильными ножницами (скальпелем) вырезают небольшой кусочек, берут его пинцетом и легким прикосновением к чистому и обезжиренному предметному стеклу делают несколько отпечатков. При отборе гноя или мокроты пастеровской пипеткой или бактериологической петлей исследуемый материал наносят на предметное стекло, накрывают другим предметным стеклом, раздавливают и разводят в разные стороны, получая при этом два мазка. При отборе крови на предметное стекло, ближе к одному из краев, наносят каплю крови. Шлифованным предметным стеклом под углом в 45 ° делают скользящее движение, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Образцы материала для микробиологического исследования следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме, достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.

Принципы организации и оборудование бактериологических лабораторий

В бактериологических лабораториях проводят исследование патологического материала с целью диагностики инфекционных болезней на туберкулез, бруцеллез, сибирскую язву, рожу свиней и др. В каждой лаборатории должны быть предусмотрены:

1) боксы для работы с отдельными группами бактерий или вирусов;

2) помещения для серологических исследований, приготовления питательных сред, стерилизации и мойки посуды; виварий с отдельными боксами для здоровых и подопытных животных. В бактериологической лаборатории должно быть оборудовано место для окраски микроскопических препаратов с набором анилиновых красителей, реактивов, спиртовок, сливных чаш, фильтровальной бумаги, банок с дезинфицирующим раствором и т. д.

Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала

При отборе и обработке патологического материала для пересылки в лабораторию необходимо придерживаться следующих правил:

- учитывать патогенез болезни и тропизм возбудителя;

- использовать стерильные инструменты и посуду;

- доставлять его в максимально сжатые сроки;

-отбирать материал до начала лечения антимикробными препаратами.

В лабораторию могут быть направлены:

- для прижизненной диагностики: кровь, сыворотка крови, кал, моча, молоко, экссудаты, гной, соскобы с кожи и др.; - для посмертной диагностики: паренхиматозные органы, лимфоузлы, мышцы, сердце целиком с кровью, головной мозг, трубчатая кость, абортированный плод и др.;

- пробы из объектов внешней среды: воды, почвы, фуража; клещи, насекомые, грызуны и др. Трупы мелких животных, а также поросят, ягнят, телят лучше посылать целиком во влагонепроницаемой таре. Трубчатые кости, посылаемые на исследование, должны быть целыми, с неповрежденными концами, обернутыми в марлю или полотно, смоченное дезинфицирующей жидкостью (5 %-ным раствором карболовой кислоты). Кровь берут в пробирки или колбы из яремной вены с соблюдением стерильности. Кал берут из прямой кишки стеклянной трубочкой с оплавленными краями, один конец трубочки закрывают ватно-марлевой пробкой. После взятия кала трубку опускают в пробирку с физиологическим раствором. Мочу у животных берут с помощью катетера. Перед отбором молока сосок вымени дезинфицируют 70 % спиртом, сдаивают 100-150 мл молока в банку с дезраствором, а последующие порции в количестве 30 мл - в стерильные сосуды. Соскобы со слизистых оболочек и кожи берут стерильным скальпелем в стерильную посуду с пробкой. Абортированный плод первой половины беременности направляют целиком. От плодов второй половины беременности берут паренхиматозные органы или плод направляют целиком. Кусочки селезенки, почек, печени с желчным пузырем берут, используя стерильные инструменты и стерильную посуду. Желудок и кишечник перевязывают лигатурой с обоих концов и помещают в отдельную посуду. Мозг для исследования направляют целиком. При упаковке патологического материала необходимо исключить загрязнение его посторонней микрофлорой из внешней среды. 88 Патологический материал должен быть доставлен в лабораторию в течение первых 24 ч после его взятия. Если эти условия трудно выполнить, то материал необходимо консервировать 30 % водным раствором глицерина или 10 % водным раствором хлористого натрия или раствором глицерина с хлористым натрием (глицерина - 250 мл; хлористого натрия - 5 г; дистиллированной воды - 750 мл). Доставка патологического материала в лабораторию осуществляется нарочным. На взятый патологический материал, направляемый в лабораторию, составляется сопроводительное письмо с подробным перечнем направляемого материала, предположительный диагноз, адрес и подпись ответственного лица.