19. Изучение биохимических (ферментативных) свойств микроорганизмов

В результате питания, дыхания, размножения каждый вид микробов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют белки, другие углеводы, третьи вызывают окисление и восстановление различных субстратов. Для каждого вида микроорганизмов характерен свой набор ферментов, поэтому их наряду с другими признаками можно использовать для идентификации.

Определение протеолитических ферментов

Некоторые микроорганизмы при росте на питательных средах выделяют протеазы, под действием которых молекулы белка расщепляются до промежуточных продуктов распада – пептонов, альбумоз, полипептидов. Под действием других ферментов эти продукты распадаются на отдельные аминокислоты. Некоторые патогенные виды микробов с выраженной протеолитической активностью расщепляют белки до конечных продуктов – индола, сероводорода, аммиака. Индол и сероводород имеют наибольшее значение при определении вида микроорганизма. Для изучения протеолитических свойств микробов исследуемую культуру высевают на питательные среды, содержащие тот или иной белок.

Определение сероводорода. Под пробку пробирки с МПБ и исследуемой культурой помещают полоску индикаторной бумаги, пропитанной ацетатом свинца (уксуснокислым свинцом). Индикаторная бумага не должна касаться питательной среды. В положительных случаях образующийся сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца. Образуется сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Определение сероводорода можно также проводить, учитывая рост культуры на комбинированных плотных средах Клиглера, Олькеницкого. Если выделяется сероводород, то в этих средах он взаимодействует сернокислым железом (соль Мора). Образуется сульфид железа черного цвета, столбик среды чернеет.

Определение индола. Индол можно обнаружить различными методами. Наиболее доступным и удобным считают метод с использованием индикаторных бумажек. При использовании бумажек с щавелевой кислотой их помещают под пробку пробирки с МПБ. При наличии индола нижняя часть бумажки окрашивается в бледно-розовый цвет. Индол можно определить с помощью реактива Эрлиха, не пользуясь индикаторными бумажками. С этой целью к 1 мл двухдневной бульонной культуры добавляют равный объем эфира и интенсивно встряхивают, затем в пробирку наливают каплями по стенке реактив Эрлиха. При наличии индола на границе между эфиром и бульонной культурой образуется яркое малиновое кольцо.

Определение аммиака проводят с помощью красной лакмусовой бумажки, которая в присутствии аммиака синеет, из-за образовавшегося нашатырного спирта.

Определение гидролиза мочевины ферментом уреазой проводят на специальных дифференциальнодиагностических средах, содержащих мочевину и индикатор (среда Кристенсена с индикатором фенол-рот, 3-х сахарный агар Олькеницкого). При расщеплении мочевины среды окрашиваются в малиновый цвет (Proteusvulgaris, Pseudomonasaeruginosa)

Мясо-пептонный желатин используют для изучения протеолитических свойств микроорганизмов. Культуры микробов, обладающих ферментом желатиназой, вызывают разжижение питательной среды. При этом микробы с аэробным типом дыхания разжижают МПЖ сверху, факультативные – по линии укола «чулком», анаэробы – на дне пробирки. Микробы со слабовыраженными протеолитическими свойствами в МПЖ образуют от линии посева едва заметные боковые отростки. При этом такой рост у аэробов характеризуют как «елочка верхушкой вниз», у факультативных анаэробов – рост в виде «ламповой щетки», а анаэробы растут в виде «елочки верхушкой вверх». Микробы с отсутствием протеолитических ферментов растут в МПЖ, не изменяя ее: аэробы – в виде кнопки на поверхности среды, факультативные – растут по укол, анаэробы – на дне пробирки. Культивирование проводят при 22 °С (рисунок 58). Посев в молоко позволяет определить у микроба наличие фермента казеазы. При наличие казеазы происходит гидролиз казеина до образования пептонов. Это вызывает просветление среды и носит название пептонизация молока. Протеолитические свойства у анаэробов определяют по почернению мозговой среды.

Определение сахаролитических свойств микробов Свойство расщеплять углеводы и многоатомные спирты (сахара) присуще многим микроорганизмам. Под действием сахаролитических ферментов сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода. Различные микробы обладают разной способностью расщеплять сахара. Одни микробы расщепляют сахара до конечных продуктов, другие только до кислот. Эти свойства учитывают при определении вида микроба.

В средах Гисса расщепление сахара до промежуточных продуктов (кислот) определяют по покраснению среды, до конечных продуктов (газов) – по накоплению пузырьков газа в специальных газовичках, помещенных в среду. При отсутствии ферментации сахара рост микробов выражается в равномерном помутнении среды без изменений цвета.

В полужидком агаре с индикатором ВР (водный голубой или розовая кислота) о расщеплении сахаров до кислот судят по изменению цвета среды с серо-розового до голубого. Образующийся при расщеплении сахара газ накапливается в толще среды.

На среде Эндо в результате расщепления лактозы, входящей в состав этой среды, происходит восстановление цвета индикатора основного фуксина, в результате чего выросшие колонии микробов окрашиваются в красный цвет. Аналогично учитывают результаты на средах Левина и Плоскирева. Лактозоположительные колонии окрашиваются на этих средах в цвет индикатора: в фиолетовый или черный на среде Левина, в розовый на среде Плоскирева. Лактозоотрицательные не окрашиваются.

В молоке при расщеплении микробом лактозы, т.е. при наличии у него фермента лактазы, происходит свертывание в результате накопления кислых продуктов.

Определение окислительно-восстановительных ферментов В культуре микробов важно определить наличие окислительновосстановительных ферментов, связанных с функцией дыхания. Диагностическое значение имеет наличие у микробов оксидазной и каталазной активности, а иногда – рецидирующей способности.

Определение оксидазы проводят несколькими методами, например по Ковачу. В этом случае на поверхность колоний суточной агаровой культуры наносят несколько капель реактива Ковача, содержащего диметилпарафенилендиамин. Через несколько секунд оксидазоположительные колонии окрашиваются в темно-красный (пурпурный) цвет. Оксидазоположительная – синегнойная палочка, оксидазоотрицательная – кишечная палочка, сальмонелла. Определение каталазы. В культуру вносят 1-2 мл 3 % перекиси водорода. При наличии у микроба каталазной активности происходит пенообразование в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы на кислород и воду. Каталазной активностью, например, обладают листерии и кампилобактеры. Не обладают – стрептококки.

Определение редуцирующих свойств

Редуцирующие свойства – способность бактерий восстанавливать одно соединение в другое, например, соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой (нитриты). Исследуемую культуру высевают на питательную среду, содержащую органическую краску (лакмусовою настойку, метиленовый синий, нейтральный красный и др.). При наличии у микроба ферментов дегидраз происходит отщепление водорода от субстрата и присоединение его к краске, в результате краситель восстанавливается и превращается в бесцветное соединение. По обесцвечиванию краски в присутствии микроба судят о редуцирующих свойствах исследуемой культуры (рисунок 60). Например, этим свойством обладают листерии и не обладает возбудитель рожи свиней, что учитывают при их дифференциации.

Определение гемолитических свойств

Проводят с целью определения вида и для дифференциации от непатогенных микробов на кровяном. При наличии у микроба гемотоксина вокруг колонии образуется зона гемолиза. Различают α-гемолиз, при котором вокруг колоний наблюдают непрозрачную зеленоватую зону свидетельствующую о неполном расщеплении гемоглобина эритроцитов и β-гемолиз, характеризующийся полным растворением эритроцитов, зона вокруг колонии прозрачная. Например, патогенные стафилококки обладают β-гемолизом, непатогенные гемолизом не обладают. Исключением являются: возбудитель сибирской язвы не имеет гемотоксина, непатогенные почвенные бациллы имеют гемотоксин.