13. Приготовление бакпрепаратов (мазков).

Мазки готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвесь бактерий, бактериальную культуру, молоко, кровь, мазки отпечатки.

Из жидкой микробной культуры для приготовления мазка в левой руке держат пробирку, в правой бактериологическую петлю. Тщательно прожигают ее в пламени горелки. Пробирку открывают у пламени горелки. Петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Наносят на предметное стекло каплю и растирают до размера рубля. Препарат выдерживают на воздухе, петлю прожигают. Препарат фиксируют – над пламенем горелки либо смесь Никифорова.

Методы фиксации мазков:

Физический способ. Для фиксации используют мазки, приготовленные из бульонных или агаровых культур. С обратной стороны мазка карандашом по стеклу или маркером обводят его границы. Стекло с мазком, обращенным вверх, медленно проводят 3-4 раза над верхней частью пламени горелки, нагревая стекло не выше 60 °С.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови, мазков- отпечатков,и в некоторых случаях, мазков и патологического материала,т.к.высокие температуры разрушают клеточные элементы. Для этих целей мазки погружают в фиксирующие жидкости: метиловый спирт – 5 мин, ацетон – 5 мин, этиловый спирт – 10 мин, смесь Никифорова – 15-20 мин.

Целью фиксации является закрепление микроорганизмов на стекле, обезвреживание микробных клеток, коагуляция белков микробных клеток, после чего они легко воспринимают окраску.

Для приготовления мазков из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей, предварительно прокаленной до красна (профламбированной) наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю фламбируют повторно, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего в пробирку (чашку Петри) с культурой вносят бактериологическую петлю, предварительно охладив ее о поверхность стекла. Петлю с культурой осторожно вынимают и вносят в приготовленную заранее на предметном стекле каплю физиологического раствора, тщательно размешивают, равномерно распределяя по стеклу в виде небольшого круга, овала (2 см в диаметре). После окончания приготовления мазка петлю вновь прокаливают.

14. Простые и сложные методы окрашивания.

Простые методы окраски бактерий

При простых методах окраски применяют только один краситель, чаще всего фуксин Пфейффера, метиленовый синий. Раствор красителя наносят на препарат и выдерживают 2-3 мин, затем краску смывают водой, препарат высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают под иммерсией. Простая окраска позволяет обнаружить в материале бактерии, быстро определить их морфологию и иметь представление о разнообразии видов.

Сложные методы окраски

Сложные методы окраски основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток, их применяют для дифференциации одних бактерий от др.

Сущность этих методов заключается в последовательном воздействии на мазок двух красящих растворов, из которых один является основным, а другой – контрастным. Кроме красящих растворов, применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты. В результате разные виды микробов или отдельные структуры внутри микробной клетки окрашиваются в контрастные и разные вещества.

Окрашенные препараты имеют следующие преимущества:

-они неопасны, т.к. все манипуляции проводят с фиксированным и обезвреженным материалом;

-в них легко различимы отдельные детали, структуры микробной клетки, не выявляющиеся в неокрашенном препарате;

-могут храниться длительное время. Недостатки:

-невозможность изучения физиологии микробов (подвижность, характер деления и т.д.);

-деформация микробных клеток после фиксации физическим методом и воздействия красящих растворов.

Окраска по Граму

Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.

Метод окраски Грама продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской и ветеринарной микробиологии.

При окраске по этому методу все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные, что облегчает проведение дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний и выбор средств антимикробной терапии.

Окраска состоит из следующих этапов:

1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную раствором генцианвиолета, капают 2 капли воды и оставляют на 2-3 мин.

2.Фильтровальную бумагу убирают, раствор сливают, добавляют раствор Люголя на 1-2 мин., сливают. Водой не промывают!

3.На 15-30 сек. Наносят на мазок 96 % спирт для обесцвечивания мазка, и немедленно промывают препарат водой!

4.На мазок наносят фуксин Пфейффера на 1-2 мин., смывают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стенки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствор Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате кра- ситель оказывается как бы«запертым»и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина (до 80 %, трехслойная оболочка, наличие тейхоевых кислот), окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тоньше (10-20 %, однослойная оболочка, нет тейхоевых кислот), поры до конца не смыкаются и спирт свободно проникает сквозь клеточную стенку и обесцвечивает бактерию. Они содержат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет

Окраска по Циль-Нильсену

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Mycobacterium. Среди них встречаются непатогенные(обитающая в сене и впервые обнаруженная в траве–тимофеевке палочка Тимофеевой травы и др.), которые обнаруживают в молоке, масле, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных, возбудителя лепры.

Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и наличием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие растворы. Поэтому применяют красители протравители и нагреванием мазка над пламенем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.

Метод окраски по Циль-Нильсену:

1.на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят карболовый фуксин Циля и нагревают до появления паров 2-3 мин.

2.бумагу удаляют пинцетом и на 5 секунд наносят на мазок 5 % раствор серной кислоты.

3.тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2-3 мин.

4.мазок промывают водой, высушивают и смотрят под иммерсией.

Микобактерии окрашиваются в красный цвет, фон (клетки ткани и некислотоустойчивые бактерии) – синий. При воздействии на мазок серной кислоты некислотоустойчивые бактерии легко обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим